我們來(lái)看這個(gè)圖片。圖片當(dāng)中,，我們看到一個(gè)象載玻片大小的芯片,。這個(gè)芯片里面，是做了8條通道,。在這個(gè)通道的內(nèi)表面,，是做了專(zhuān)門(mén)的化學(xué)修飾。它的化學(xué)修飾,，主要是用2種DNA引物,，把它（2種DNA引物）種在玻璃表面。

這兩種（DNA引物的）序列是和接下來(lái)要測(cè)序的DNA文庫(kù)的接頭序列相互補(bǔ)的,。而且這2種引物是通過(guò)共價(jià)鍵,，連到Flowcell上去。之所以要用共價(jià)鍵連到Flowcell上去,，是因?yàn)榻酉聛?lái)有大量的液體要流過(guò)這個(gè)Flowcell,，只有有共價(jià)鍵連接的這些DNA，才不會(huì)被沖掉,。這就是Flowcell,。

文庫(kù)制作

再接下來(lái)，講一下文庫(kù),、和文庫(kù)的制作（過(guò)程）所謂的DNA文庫(kù),，實(shí)際上是許多個(gè)DNA片段，在兩頭接上了特定的DNA接頭,，型成的DNA混合物,。

文庫(kù)有2個(gè)特點(diǎn)，第1個(gè)特點(diǎn),，是當(dāng)中這一段插入的DNA,，它的序列是各種各樣的。第2個(gè)特點(diǎn),，它的兩頭的接頭序列,，是已知的，而且是人工特地加上去的,。要做這個(gè)文庫(kù),，首先是把基因組DNA，用超聲波打斷,。然后打斷之后,，兩頭用酶把它補(bǔ)平，再用Klenow酶在3'端加上一個(gè)A堿基,。然后,，再用連接酶把這個(gè)接頭給連上去。

連好了接頭的DNA混合物,，我們就稱(chēng)為一個(gè)“文庫(kù)”,。英文也稱(chēng)作“library”。

橋式PCR

做好了Library之后,，就要做橋式PCR了,。橋式PCR，實(shí)際上是把文庫(kù)種到芯片上去,，然后進(jìn)行擴(kuò)增,，這樣的一個(gè)過(guò)程。

這個(gè)過(guò)程,，首先是把文庫(kù)加入到芯片上,，因?yàn)槲膸?kù)兩頭的DNA序列，和芯片上引物是互補(bǔ)的,，所以,，就會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)雜交。

雜交完了之后,，我們?cè)谶@里面加入dNP和聚合酶,。聚合酶會(huì)從引物開(kāi)始，延著模板合成出一條全新的DNA鏈來(lái),。

新的這條鏈,，和原來(lái)的序列是*互補(bǔ)的。

接下來(lái),，我們?cè)偌尤隢aOH堿溶液,。DNA雙鏈在NaOH堿溶液存在下，就解鏈了,。而且被液流一沖,，原來(lái)的那個(gè)（模板）鏈，也就是沒(méi)有和芯片共價(jià)連接的鏈,，就被沖走了,。而和芯片共價(jià)連接的鏈，就被保留下來(lái),。

然后,，我們?cè)僭谝毫鞒乩锛尤胫行砸后w，主要是為了中和這個(gè)堿液,，在加入中和液之后,，整個(gè)環(huán)境變成中性了,。這時(shí)侯，DNA鏈上的另外一端,，就會(huì)和玻璃板上的第二種引物,，發(fā)生互補(bǔ)雜交。

接下來(lái),，我們加入酶和dNTP,，聚合酶就延著第二個(gè)引物，合成出一條新鏈來(lái),；然后,，我們?cè)偌訅A，把2條鏈解鏈解開(kāi),；然后,，我們?cè)偌又泻鸵海@時(shí)侯,，DNA鏈會(huì)和新的引物雜交,。再加酶，再加dNTP,，又從新引物合成出新的鏈來(lái),。

連續(xù)重復(fù)這一過(guò)程，DNA鏈的數(shù)量,，就會(huì)以指數(shù)方式增長(zhǎng),。

制備單鏈

在橋式PCR完成之后，接下來(lái)要做的工作,，就是要把合成的雙鏈,，變成可以測(cè)序的單鏈。

辦法是通過(guò)一個(gè)化學(xué)反應(yīng),，把其中一個(gè)引物上的一個(gè)特定的基團(tuán)給切斷掉,。

然后，再用堿溶液來(lái)洗這個(gè)芯片,。這時(shí)侯,，堿讓DNA的雙鏈解鏈，那根被切斷了根的DNA鏈就被水沖掉了,。留下那根共價(jià)鍵連在（芯片）上面的鏈,。

接下來(lái)，再加入中性溶液,，然后在這個(gè)中性溶液里面加入測(cè)序引物,。

正式測(cè)序

好，接下來(lái)正式的測(cè)序工作就開(kāi)始了。

那么,，在測(cè)序的時(shí)侯,，加入進(jìn)去的，主要是2個(gè)東西：一個(gè)是帶熒光標(biāo)記的dNTP,。而這個(gè)dNTP,，它還有一個(gè)特點(diǎn)，它的3'末端是被一個(gè)疊氮基堵住的,。

然后，再加一個(gè)聚合酶,，聚合酶就會(huì)選擇：哪一個(gè)dNTP是和原來(lái)位置上的那個(gè)堿基是互補(bǔ)的,，根據(jù)互補(bǔ)性原理，把這個(gè)dNTP合成到新的這個(gè)DNA鏈上去,。

因?yàn)檫@個(gè)dNTP的3'端是被一個(gè)疊氮基團(tuán)堵住了,，所以，它一個(gè)循環(huán)只能延長(zhǎng)一個(gè)堿基,。然后,，它就停在那兒了。

合成完了之后,，就用水把多余的dNTP和酶給沖掉,。

沖掉之后，就放到顯微鏡下,，去進(jìn)行激光掃描,。根據(jù)發(fā)出來(lái)的熒光來(lái)判斷它是哪個(gè)堿基。

因?yàn)?種dNTP,，它每一種dNTP上面標(biāo)的熒光素都不一樣,，根據(jù)紅、黃,、藍(lán),、綠，它出來(lái)的哪種顏色,，那么,，就可以倒過(guò)來(lái)推出來(lái)，這個(gè)新合成上去的堿基,，是哪種堿基,。

因?yàn)樾潞铣傻膲A基，是和原來(lái)位置（的堿基）是互補(bǔ)的,，所以,，又推出模板上那個(gè)堿基是哪個(gè)。

這一個(gè)循環(huán)完成之后，就加入一些化學(xué)試劑,，把疊氮基團(tuán)和旁邊標(biāo)記的熒光基團(tuán)切掉,。切完了之后，3'端的羥基就暴露出來(lái),。

再接下來(lái),，加入新的dNTP和新的酶，然后,，又延長(zhǎng)一個(gè)堿基,。新延長(zhǎng)完一個(gè)堿基之后，把多余的酶和dNTP沖掉,，再進(jìn)行一輪顯微的激光掃描,，再讀一下這個(gè)堿基是什么。

不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程,，可以重復(fù)上百次,，到幾百次，就可以把上百個(gè)堿基,，甚至更多堿基的序列讀出來(lái),。

讀Index

那么，什么是Index哪,？是因?yàn)镮llumina的評(píng)委會(huì)個(gè)測(cè)序量很大,，往往一個(gè)樣本，用不了那么幾億條DNA,。所以,，科學(xué)家就想了一個(gè)辦法。在文庫(kù)的接頭上做了一些標(biāo)記,，每一個(gè)樣本,，它有一個(gè)特定的接頭，每個(gè)接頭里面,，它有一段特定的序列,。

這段特定的序列，我們就稱(chēng)為Index,。也有人把它叫做Barcode,，反正，表達(dá)的是一個(gè)意思：這么一段特定的序列,，標(biāo)記了樣本的來(lái)源,。

那么，要讀這個(gè)Index的序列,，先用堿把上面這根測(cè)完“Read1”的序列,，把上面這根DNA鏈給解鏈掉。

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