一,、色譜柱參數(shù)及其意義

選擇色譜柱時(shí)應(yīng)考慮不同色譜柱參數(shù)的影響,，以下內(nèi)容對(duì)色譜柱的參數(shù)進(jìn)行分析。

1,、色譜柱尺寸

較長的色譜柱組分保留較強(qiáng),，運(yùn)行時(shí)間較長，柱效更高,，分離度效果更好,。在實(shí)際工作中應(yīng)綜合衡量運(yùn)行時(shí)間和柱效，選擇長度適宜的色譜柱,。例如含量測定,、溶出檢測對(duì)于分離的要求較低,，可選用較短的色譜柱，減少運(yùn)行時(shí)間,；有關(guān)物質(zhì)一般選擇較長的色譜柱,，提高分離效果。

內(nèi)徑小的色譜柱靈敏度較高,，峰型更窄,，但是載樣量較小。如果載樣量滿足要求,，需要更高更尖銳的峰提高靈敏度,，可以選擇更小內(nèi)徑。但是如果進(jìn)樣量超過了柱載樣量,，色譜峰將極大變寬,。所以應(yīng)在靈敏度和載樣量之間綜合衡量。

粒徑小的色譜柱分離度較好,，色譜柱壓力更大,。如果5μm粒徑的色譜柱分離度稍有不足，則同型號(hào)3μm色譜柱的分離度一般會(huì)提供令人滿意的選擇性,。

如果選擇較小尺寸的色譜柱,，應(yīng)衡量柱外死體積對(duì)柱效的影響，柱外死體積包括連接管線,、進(jìn)樣體積,、色譜柱接頭與色譜柱連接處的空隙等。所以一般超液相使用的色譜柱不適用于常規(guī)液相儀,。小規(guī)格色譜柱使用同一品牌的儀器,，減少連接處空隙引入的死體積。題外話：島津,、安捷倫,、waters之間儀器管線接頭和色譜柱不匹配，儀器和色譜柱品牌不一致必然引入較大連接空隙,，應(yīng)注意這方面的影響。

2,、其他參數(shù)

高比表面積具有較強(qiáng)的保留能力,、柱容量和分離度，低比表面積能更快達(dá)到平衡狀態(tài),，這點(diǎn)在梯度淋洗中很有意義,。

大孔徑的填料可以延長大分子在填料中的滯留時(shí)間，達(dá)到充分分離,，改善峰型,。大分子樣品一般應(yīng)選擇較大孔徑色譜柱，如蛋白質(zhì)、多肽類,。

單齒鍵合色譜柱平衡更快,；雙齒鍵合穩(wěn)定性較好，柱容量較大,。

碳栽量大保留較強(qiáng),，分離效果較好。反之保留較弱,，分離效果較差,。

封尾（也稱封端）柱能減輕堿性組分（陽離子）與硅膠表面殘留硅氧負(fù)離子作用而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象；對(duì)于極性樣品經(jīng)封尾處理與未經(jīng)封尾處理的色譜柱選擇性也不同,。一般堿性化合物應(yīng)選擇封尾處理的色譜柱,。

二、常見固定相解析

1,、直鏈烷烴（C18,、C8、C6,、C4,、C3……）

非極性和極性較弱的化合物常選擇該類固定相色譜柱。一般來說,，鏈長越長,，柱容量更大，保留時(shí)間更長,，分離效果更好,，柱穩(wěn)定性更好。因此C18是zui常用的一種反相色譜柱,，但是某些組分如大分子樣品因其保留太強(qiáng),，使用C18難以洗脫，會(huì)用到更短鏈固定相色譜柱（如C4等）,。在開發(fā)方法的時(shí)候如果使用C18柱,，zui難洗脫的組分在流動(dòng)性允許的有機(jī)相zui高比例下保留仍然太強(qiáng)導(dǎo)致運(yùn)行時(shí)間際過長，就可以考慮使用C8柱,。

該類固定相的保留機(jī)制是“相似相溶”的液液分配色譜,，固定相為小極性碳鏈，組分中依極性大小的不同而保留不同,，極性越小保留越強(qiáng),。組分在該類色譜柱中的保留可根據(jù)極性的相對(duì)大小判斷不同組分的洗脫順序。例如苯與苯酚,，苯酚因?yàn)槎嗔艘粋€(gè)羥基,，極性變大,，在C18柱中更快洗脫下來。

該類柱在方法開發(fā)上有一個(gè)zui大的優(yōu)點(diǎn)是保留情況可以預(yù)測,，比如一般減少有機(jī)相比例會(huì)增加保留,，分離度增加等等。

2,、苯基 

保留機(jī)制同直鏈烷烴,，它對(duì)于含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物有良好的分辨能力，尤其是苯環(huán)上的細(xì)微差別,，如結(jié)構(gòu)式中有無鹵素,、官能團(tuán)在苯環(huán)所處位置不同等。

3,、氰基

CN(氰基)填料由于其具有中等極性的氰基鍵合固定相,，其既可用于正相色譜，又可用于反相色譜,。其在用于正相色譜時(shí),，可使用如正己烷的低極性流動(dòng)相，在用于反相色譜時(shí),，可使用甲醇或水的強(qiáng)極性流動(dòng)相,。
 

CN柱的疏水性在反相色譜固定相中相對(duì)較低，并且由于具有π-電子作用腈基,，其與ODS相比顯示出不同的選擇性,。CN柱適用于在ODS上保留時(shí)間太長的組分的分離，以及在ODS上優(yōu)化色譜非常困難的場合,。CN柱也可用于在ODS上保留太小的強(qiáng)極性化合物的檢測,。如果組分間極性相差太大，CN柱或許可以提供一個(gè)令人滿意的結(jié)果,。如本人曾經(jīng)在一個(gè)項(xiàng)目的溶出方法學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),，藥典方法規(guī)定的C18柱在多次分析溶出樣品后主峰變形，經(jīng)過調(diào)查確認(rèn)是膠囊殼中強(qiáng)保留組分無法洗脫引起,，于是選擇CN柱,，連續(xù)分析數(shù)千樣品，柱效依然良好,。

CN柱的保留隨著有機(jī)相比例變化的趨勢不像直鏈烷烴柱那么明顯,，有些情況下有機(jī)相變化百分之幾十，保留時(shí)間也未發(fā)生明顯變化,，這點(diǎn)需要注意。

4,、氨基

氨基柱是由極性基團(tuán)氨丙硅烷基鍵合在硅膠上形成的極性鍵合相色譜柱,。一般可正相使用,，也可反相使用。一般用于糖類,、碳水化合物的分析,。

目前氨基柱的分離原理主流說法是氫鍵作用力及范德華力，由此可以看出氨基柱一般不用于易解離化合物的分析,。原因有二：一是氨基柱非常不穩(wěn)定,，易解離化合物一般都需要使用緩沖鹽，加速了氨基柱固定相的破壞,；二是氨基柱對(duì)于易解離化合物的保留機(jī)制非常復(fù)雜,，除了上述的氫鍵和范德華力外，還有離子交換色譜的機(jī)制,，如堿性化合物與氨基固定相相互離子間排斥,、酸性化合物與氨基相互吸引等，使得色譜行為更加難以預(yù)測,。目前氨基柱zui常用于糖類的分析,，流動(dòng)性使用水-有機(jī)相系統(tǒng)。

該類色譜柱的zui大缺點(diǎn)就是穩(wěn)定性差,，柱的使用壽命非常短,。

5、HILIC（親水作用色譜）
 

本柱為兩性離子的固定相共價(jià)結(jié)合于多孔硅膠上,，適用于反相色譜中保留較弱或者根本不保留的強(qiáng)離子化樣品檢測,，解決了正相色譜用于該領(lǐng)域樣品難以溶解性的問題。這是比較新的一類色譜柱,，目前相應(yīng)的研究內(nèi)容較少,。

HILIC柱的分離機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)方面：液液分配,、離子交換,、偶極-偶極間作用、氫鍵等,，很多實(shí)驗(yàn)表明HILIC的保留機(jī)制是上述多種機(jī)制的共同作用,。

典型的HILIC流動(dòng)相一般為水或緩沖液中含40%-97%乙腈，一般不應(yīng)使用純乙腈,。組分的保留時(shí)間一般隨著有機(jī)相比例的增加而增加,，隨著水的比例增加而減少。所以梯度設(shè)置和反相色譜正好相反,，是一個(gè)有機(jī)相比例逐漸減少的過程,。

樣品不得使用純水溶解，水的比例與流動(dòng)相初始比例一致,，原理與反相色譜常見的“溶劑效應(yīng)”一樣,。

6,、離子交換柱

分為陰離子交換柱和陽離子交換柱，主要用于強(qiáng)離子組分的檢測,，如金屬離子,、酸根等的檢測。zui常見用于離子色譜儀,，如組分有紫外響應(yīng),，也可以用于一般液相儀中。其原理及應(yīng)用已有較多的研究內(nèi)容,，本文就不做詳細(xì)介紹,。

7、其他

上述6類色譜柱已經(jīng)包含了絕大部分的實(shí)驗(yàn)室常見色譜柱,，其他如手性柱或特殊填料色譜柱由于性質(zhì)差異較大或應(yīng)用較少,，篇幅有限本文就不做詳細(xì)介紹了。

三,、色譜柱相關(guān)的一些其他內(nèi)容

1,、色譜柱流向

一般來說，應(yīng)安裝色譜柱上規(guī)定的箭頭方向設(shè)置流動(dòng)相的方向,。如色譜柱壓力明顯增高,，可將色譜柱斷開檢測器調(diào)頭反沖，如此操作之后色譜柱反向使用,。避免頻繁更換色譜柱中流動(dòng)相的流向,，因?yàn)樯V柱的鍵合相是有排列方向的，頻繁更換色譜柱中流動(dòng)相的流向會(huì)破壞這種排列,，降低色譜柱性能,。

2、pH值穩(wěn)定性

上文中提過鍵合相碳鏈越長越穩(wěn)定,，其意義是越長的碳鏈在低pH值下不易水解,，由此可以得出結(jié)論是經(jīng)過短鏈封尾處理的色譜柱應(yīng)避免在低pH值（＜2)條件下使用。在高pH值下,，由于硅膠上帶有硅氧負(fù)離子,，硅膠將會(huì)溶解，由此可以得出封尾處理后的色譜柱在高pH值下穩(wěn)定性較好的結(jié)論,。在方法開發(fā)及樣品檢測中可以根據(jù)上述結(jié)論選擇色譜柱,，提高色譜柱壽命。