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使用超濾離心管需要注意什么
閱讀：1834 發(fā)布時(shí)間：2019-7-12
超濾離心管,，備有四種材質(zhì)的超濾膜：聚醚砜、三醋酸纖維素、再生纖維素和Hydrosart,，可根據(jù)不同要求靈活選用,。
使用注意事項(xiàng)
（1）選擇合適的超濾管,。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管,。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說(shuō)明書,，注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同,。
（2）新買來(lái)的超濾是干燥的,，使用前加入超純水,，水量*過(guò)膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘,。然后將水倒出,，即可加入蛋白液，加入的多少,，以不超過(guò)管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn),。操作要輕，加入蛋白液前,，超濾管需要插在冰上預(yù)冷,。
（3）平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡,。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜,。開始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）,。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同,。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔,，減小對(duì)膜的壓力。注意,，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,，方可離開離心機(jī)，否則離心機(jī)出問(wèn)題時(shí),，無(wú)法時(shí)間處理,。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說(shuō)明書調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）,。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說(shuō)明書里的要低,，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命,。
（4）當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí),，取50ul緩沖溶液,，加入10ul流穿，看有沒變藍(lán)色,，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾,。要判斷是否漏管,，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿,，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè),，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱）,，直到所有濃縮液都加完為止,。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管,。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適,；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的緩沖溶液,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
?。?）前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候,，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾）,，再 濃縮至1ml左右，連續(xù)三次,，后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況,。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,，三次達(dá)到1000倍以上,，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。