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使用超濾離心管需要注意什么
閱讀：1803 發(fā)布時間：2019-7-12
超濾離心管,，備有四種材質(zhì)的超濾膜：聚醚砜,、三醋酸纖維素、再生纖維素和Hydrosart,，可根據(jù)不同要求靈活選用,。
使用注意事項
（1）選擇合適的超濾管,。通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管,。認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質(zhì)的耐受程度有所不同,。
?。?）新買來的超濾是干燥的，使用前加入超純水,，水量*過膜,，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出,，即可加入蛋白液,，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準,。操作要輕,，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷,。
?。?）平衡。質(zhì)量和重心二者都要達到平衡,。注意轉速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）,。不同離心機的轉速 rpm換算成g之后,，有所不同。離心機的加速度調(diào)至低檔,，減小對膜的壓力,。注意，一定要等離心機達到目的轉速之后,，方可離開離心機,，否則離心機出問題時，無法時間處理,。膜與轉軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）,。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長離心管的使用壽命,。
（4）當濃縮到剩下1ml時,，取50ul緩沖溶液,，加入10ul流穿,，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要判斷是否漏管,，用5mgml的BSA離心10min,，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測,，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作,，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止,。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導致堵管,。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適,；前者可用多根超濾管同時超濾,，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的緩沖溶液,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止,。
（5）前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾）,，再 濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次，后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,，三次達到1000倍以上,，基本上可以達到換buffer的目的。