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上海嘉鵬
主營產品： 超微量分光光度計,核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計,nano光度計,超微量核酸蛋白檢測儀 |
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2016-7-27 閱讀(3501)
不同的蛋白質分離純化的方法不同，但蛋白質分離純化的操作步驟基本類似,，那么如何進行細菌蛋白的提取呢,？這里總結細菌蛋白的提取的實驗試劑、操作步驟以及一些注意事項,。
實驗試劑
采用T7• Tag Affinity Purification Kit
T7•Tag抗體瓊脂,。B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4,，2.7 mM KCl,， 0.137mM NaCl，1%吐溫-20,，pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸,，pH2.2. 中和緩沖液：2M Tris，pH10.4,。 PEG 20000,。
實驗步驟
1.100ml 含重組表達質粒的菌體誘導后，離心5000g×5min,，棄上清,，收獲菌體，用10ml預冷的B/W緩沖液重懸,。
2. 重懸液于冰上超聲處理,，直至樣品不再粘稠,，4℃離心 14000g×30min，取上清液,，0.45μm膜抽濾后作為樣品液,。
3. 將結合T7•Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫,，裝入層析柱中,。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。
5. 10ml B/W緩沖液過柱,，洗去未結合蛋白,。
6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml,，洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集,，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析,。
7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中,，雙蒸水透析24hr，中間換液數(shù)次,。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白,。
注意事項
蛋白在過層析柱前，要0.45μm膜抽濾,，否則幾次純化后,，柱子中會有不溶物。
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