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實(shí)驗(yàn)原理

測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有凱氏定氮法,；比色法主要包括雙縮脲法,、Folin-酚試劑法及 染料結(jié)合法,；紫外分光光度法等
雙縮脲(Biuret)法：在堿性溶液中,，雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與二價(jià)銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物,，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個(gè)或二個(gè)以上酰胺基(—CO—NH2),，或與此相似的基團(tuán)[如—CH2—NH2,，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物,，無論這類基團(tuán)直接相連還是通過一個(gè)碳或氮原子間接相連,，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—),，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng),，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量,。與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較,，經(jīng)計(jì)算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。
實(shí)驗(yàn)試劑

1．6mol/L氫氧化鈉溶液  
稱取氫氧化鈉(NaOH,，優(yōu)級純)240g，用新鮮蒸餾水配制成1L,，置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里,。
2．雙縮脲試劑  
稱取未失結(jié)晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20) 3.0g，溶于500m1新鮮蒸餾水中,，加酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g,，碘化鉀(KI)5.0g，待安全
溶解后,，加入6mol/L氫氧化鈉溶液100ml,，zui后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里,，約穩(wěn)定6個(gè)月,。
3．蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 
可用商品血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或定值質(zhì)控血清為標(biāo)準(zhǔn)。亦可收集混合新鮮血清,，用凱氏定氮法標(biāo)定后,，加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃0.5~1.0g/L)，冰凍
保存,。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備

恒溫水浴箱,、722（721）分光光度計(jì),、吸管、試管,、坐標(biāo)紙
實(shí)驗(yàn)步驟

1.   配制20g／L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液  如蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為70g／L,，則取此液2m1，加入新鮮蒸餾水5ml,，混勻即成,。
2.   按表操作
 
    加入物（ml）  空白管   1    2    3    4    5 測定管
20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液     ～    0.1    0.2   0.3       0.4       0.5        ～   
蒸餾水    0.5    0.4    0.3   0.2    0.1   ～      0.4
待測樣品液體   ～     ～    ～       ～     ～      ～        0.1
雙縮脲試劑     3.0   3.0     3.0       3.0        3.0       3.0       3.0     
相當(dāng)血液蛋白質(zhì)（g/L）      ～      20    40    60    80   100    
混勻，置37℃水浴10min(或25℃30min),，用540nm波長比色,，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度,。
3.   標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
1—5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管,，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo),，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
4.   實(shí)驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)測定管吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對應(yīng)的總蛋白濃度,。 
 
注意事項(xiàng)

1．雙縮脲試劑中,，加入酒石酸鉀鈉，Cu2 形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子,，以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀,。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比
      不低于3：1，加入KI作為抗氧化試劑,。
2．雙縮脲試劑要封閉貯存．防止吸收空氣中的二氧化碳,。
3．本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好,，幾乎不受溫度影響,，*缺點(diǎn)是靈敏度較低。
4．黃疸血清．嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾,。

5．本法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是一條通過原點(diǎn)的直線,，在100g/L濃度之內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

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