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上海嘉鵬
主營(yíng)產(chǎn)品： 超微量分光光度計(jì),核酸蛋白檢測(cè)儀,超微量紫外分光光度計(jì),nano光度計(jì),超微量核酸蛋白檢測(cè)儀 |
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2019-2-28 閱讀(2581)
（一）原理
凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應(yīng)除去,，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法,，這兩種方法各有利弊,。前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后析品終體積較小，但所需時(shí)間較長(zhǎng),，且鹽不易除盡,；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時(shí)間也短,，但其凝膠過濾后樣品體積較大,。所以，要根據(jù)具體情況選擇使用,。前實(shí)驗(yàn)中樣品體積較小,，凝膠達(dá)濾后樣品體積不會(huì)太增加，所以選用凝膠過濾法,。
（二）試劑與器材
（1）Sephadex G-25,。
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液,。
（3）奈氏（Nessler）試劑：于500ml錐形瓶?jī)?nèi)加入碘化鉀150g,，碘110g,，汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7～15min,，至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時(shí),，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩,，直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的碘化鉀汞液為止,。將上清液傾入2000ml量筒內(nèi)，加蒸餾水至2000ml,，混勻備用,。
（4）20%（W/V）磺基水楊酸溶液。
（5）1.5cm×20cm層析柱,。
（6）黑,、白比色磁盤。
（三）操作
（1）取層析柱1支（1.5cm×20cm）,，垂直固定在支架上,，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去,，加入2倍體積的0.0175mol/L,，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液,，然后灌注入柱,，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25,，使凝膠自然沉降高度到17cm左右,，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后,，在洗脫瓶中加入0.0175mol/L,，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠,。
（2）凝膠平衡后,，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面,，打開柱下口,，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L,，pH6.7磷酸鹽緩沖液,，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5ml/min左右,。用試管收集洗脫液,，每管10滴,。
（3）在開始收集洗脫液的同時(shí)檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出。為此,，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中,，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn),，直到檢查不出白色沉淀時(shí),，停止收集洗脫液。
（4）由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中,，取1滴溶液,，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑,，若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液,，即為“脫鹽”后的IgG,。
注意：在檢測(cè)時(shí)，用皮頭滴管吸取管中溶液后應(yīng)及時(shí)洗凈,，再吸取下一管,，以免造成相互污染假象。
