出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,，65℃左右退火與延伸),。
 
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差,，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度,。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。
 
克隆PCR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的優(yōu)條件是什么？
摩爾數(shù)比1：8或8：1也行,。應(yīng)測(cè)定比值范圍,。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul,。室溫保溫1小時(shí),，或4℃過夜。在這2種溫度下,，缺T-凸出端的載體會(huì)自連,，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求,，為提高連接效率，需4℃過夜,。
 
2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化,？
如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶,，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,，可能是積累了大量引物的二聚體,。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆,，而非目的插入片段,。為此需在克隆前做凝膠純化。
 
3)如果沒有回收到目的片段,，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn),？
A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。
如有菌落,，表明氨芐失效,，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落,。
B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率,。
例如,，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后,，用100ul鋪板,。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落,。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量,。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA,，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,，用1/10鋪板，共用1 ng DNA,。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒有菌落或少有菌落,，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。
C）如用pGEM-T正對(duì)照,，或PCR產(chǎn)物,，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T,?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804,，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染,，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,，連接pGEM-T正對(duì)照,，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落,，其中60%應(yīng)為白斑,，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題,。
 
4)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題,？
A）連接用室溫保溫1小時(shí),，能滿足大多數(shù)克隆，為提率,，需4℃過夜,。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失,，或抑制連接,，抑制轉(zhuǎn)化。為此,，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合,，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù),，插入片段需純化,，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,，插入片段污染有核酸酶,，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接,。用凝膠純化的插入片段,，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生,。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體,，不利于連接，DNA必需重新純化,。
D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需,。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）,。
E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定,，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排,，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排,，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞

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