蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，不同體積大小和MWCO超濾管可選,，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積,、濃縮目標(biāo)體積而定。

密理博超濾管,，密理博超濾管,，超濾離心管0.5ML分子量 30KD

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使用注意事項(xiàng)

（1）選擇合適的超濾管。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管,。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書,，注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同,。

（2）新買來的超濾是干燥的，使用前加入超純水,，水量*過膜,，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,，即可加入蛋白液,，加入的多少,，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕,，加入蛋白液前,，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。

（3）平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡,。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）,。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后,，有所不同。離心機(jī)的加速度調(diào)至zui低檔,，減小對膜的壓力,。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,，方可離開離心機(jī),，否則離心機(jī)出問題時(shí)，無法*時(shí)間處理,。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）,。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長離心管的使用壽命,。

（4）當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，取50ul緩沖溶液,，加入10ul流穿,，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管,，用5mgml的BSA離心10min,，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測,，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作,，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止,。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾,，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的緩沖溶液，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止,。

（5）前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾）,，再 濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次，zui后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,，三次達(dá)到1000倍以上,，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。^[