凱氏定氮儀的原理及使用

閱讀：1981發(fā)布時間：2023-9-28

凱氏定氮儀是根據(jù)蛋白質(zhì)中氮的含量恒定的原理,，通過測定樣品中氮的含量從而計算蛋白質(zhì)含量的儀器。因其蛋白質(zhì)含量測量計算的方法叫做凱氏定氮法,，故被稱為凱氏定氮儀,，又名定氮儀、蛋白質(zhì)測定儀,、粗蛋白測定儀,。

原理

將有機化合物與硫酸共熱使其中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。在這一步中,，經(jīng)常會向混合物中加入硫酸鉀來提高中間產(chǎn)物的沸點,。樣本的分析過程的終點很好判斷，因為這時混合物會變得無色且透明（開始時很暗）

在得到的溶液中加入少量氫氧化鈉,，然后蒸餾,。這一步會將銨鹽轉(zhuǎn)化成氨。而總氨量（由樣本的含氮量直接決定）會由反滴定法確定：冷凝管的末端會浸在硼酸溶液中,。氨會和酸反應(yīng),，而過量的酸則會在甲基橙的指示下用碳酸鈉滴定。滴定所得的結(jié)果乘以特定的轉(zhuǎn)換因子就可以得到結(jié)果,。

使用步驟

消化

1,、準備6個凱氏燒瓶，標號,。1,、2、3號燒瓶中分別加入適當濃度的蛋白溶液1.0mL,，樣品要加到燒瓶底部,，切勿沾在瓶口及瓶頸上,。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL,，30%過氧化氫1.0mL,。4、5,、6號燒瓶作為空白對照,，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定進行校正,。4,、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液,，其余所加試劑與1,、2、3號燒瓶相同,。2,、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置,。先用微火加熱煮沸,，此時燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫,，務(wù)必注意防止氣泡沖出管口,。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力,，保持瓶內(nèi)液體微沸,，至溶液澄清后,，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min,。在消化過程中要隨時轉(zhuǎn)動燒瓶，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能流入底部,，以保證樣品完全消化,。消化時放出的氣體內(nèi)含SO2，具有強烈刺激性,，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出,。整個消化過程均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進行。消化完全后,，關(guān)閉火焰,，使燒瓶冷卻至室溫。

蒸餾吸收

蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進行的,。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多,，大體上都由蒸氣發(fā)生,、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。

1,、儀器的洗滌

儀器安裝前,，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所用橡皮管,、塞須浸在10%NaOH溶液中,，煮約10min，水洗,、水煮10min,，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上,。儀器使用前,，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨,，正在使用的儀器,，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可,。較長時間未使用的儀器,，重復(fù)蒸氣洗滌，不得少于三次,，并檢查儀器是否正常,。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣,。首先在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水,，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果,，并放入少許沸石（或毛細管等）,，以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應(yīng)室,，但玻杯內(nèi)的水不要放光,，塞上棒狀玻塞，保持水封,，防止漏氣,。蒸氣發(fā)生后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān),，使蒸氣只能進入反應(yīng)室,，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮球進入冷凝管冷卻,，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水,。從定氮球發(fā)燙開始計時,，連續(xù)蒸煮5min，然后移開煤氣燈,。沖洗完畢,，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低,，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動抽到反應(yīng)室外殼中,，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次,，再在冷凝管下?lián)Q放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中,，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色,。如不變色,，表示蒸餾裝置內(nèi)部已洗干凈。移去錐形瓶,，再蒸餾1～2min,，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈,，儀器即可供測樣品使用,。

滴定

樣品和空白蒸餾完畢后，一起進行滴定,。打開接受瓶蓋,，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內(nèi)溶液呈暗灰色時,，用蒸餾水將錐形瓶內(nèi)壁四周淋洗一次,。若振搖后復(fù)現(xiàn)綠色，應(yīng)再小心滴入標準鹽酸溶液半滴,，振搖觀察瓶內(nèi)溶液顏色變化,，暗灰色在一二分鐘內(nèi)不變，當視為到達滴定終點,。若呈粉紅色,，表明已超越滴定終點,，可在已滴定耗用的標準鹽酸溶液用量中減去0.02mL,，每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致?？瞻讓φ找航邮芷績?nèi)的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色,，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數(shù),，供計算用,。

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