RNAi實驗原理與方法

實驗原理

通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps),。在起始階段,，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs),。證據(jù)表明,；一個稱為Dicer的酶,，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基,，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA,，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出,。

在RNAi效應(yīng)階段,，siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程,。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上,，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了,，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶,。

另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.

實驗試劑

 RNase III,、 DNA Oligo,、Taq酶、dNTP,、氯化鈣,、磷酸緩沖液、克隆所需試劑,、 siRNA合成試劑盒等

實驗步驟

(一)siRNA的設(shè)計

1. 在設(shè)計RNAi實驗時,，可以先在以下進行目標序列的篩選：

1.       RNAi目標序列的選取原則：

(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列,，并記下其3'端的19個堿基序列,，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效,。

Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions,，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域,，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果,。

(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠,，大鼠等等）進行比較,，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

(3)選出合適的目標序列進行合成,。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA,，以找到zui有效的siRNA序列。

3.陰性對照

一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照,，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成,，但是和mRNA沒有明顯的同源性,。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性,。

4.目前已證實的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁找到：

(二)siRNA的制備

目前為止較為常用的方法有通過化學(xué)合成,，體外轉(zhuǎn)錄，長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA,，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA,。

體外制備

1.化學(xué)合成

許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA,。主要的缺點包括價格高，定制周期長,，特別是有特殊需求的,。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了,，比較常見的做法是用其他方法篩選出zui有效的序列再進行化學(xué)合成,。zui適用于：已經(jīng)找到zui有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究,。不適用于：篩選siRNA等長時間的研究,，主要原因是價格因素

2.體外轉(zhuǎn)錄

以DNA Oligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs,，成本相對化學(xué)合成法而言比較低,，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制,，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs,，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比,，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間,。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好,，效率高,，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達到化學(xué)合成siRNA所能達到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高,。zui適用于：篩選siRNAs,，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價格成為障礙時,。不適用于：實驗需要大量的,，一個特定的siRNA。長期研究,。

3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA,。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷,。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ,，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化,，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后,，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞,，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs,，通常能夠保證目的基因被有效地抑制,。

dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）,。不過這種方法的缺點也很明顯,，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響,。

zui適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型

不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究,，特別是基因治療體內(nèi)表達前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs,，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs,。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA,。

4. siRNA表達載體

多數(shù)的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達,。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子,。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的,。要使用這類載體,，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火,，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動子下游,。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間,，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的,。siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久,。

病毒載體也可用于siRNA表達,，其優(yōu)勢在于可以直接率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。zui適用于：已知一個有效的siRNA序列,，需要維持較長時間的基因沉默,。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）,。

5. siRNA表達框架

siRNA表達框架(siRNA expression cassettes,，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子,，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA,，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導(dǎo)入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中,。和siRNA表達載體不同的是,，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟,，可以直接由PCR得到，不用一天的時間,。因此,，SECs成為篩選siRNA的zui有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的zui適搭配,。如果在PCR兩端添加酶切位點,，那么通過SECs篩選出的zui有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達載體,。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究,。

這個方法的主要缺點是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想,。zui適用于：篩選siRNA序列,，在克隆到載體前篩選*啟動子不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

(三)siRNA的轉(zhuǎn)染

將制備好的siRNA,，siRNA表達載體或表達框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細胞中的方法：

將氯化鈣,，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒,。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質(zhì),。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準,，保證質(zhì)量,，因為甚至偏離*條件十分之一個pH都會導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。

注意事項

為了達到高的轉(zhuǎn)染效率,，在轉(zhuǎn)染實驗過程中,，需要注意以下幾點：

1.純化siRNA

在轉(zhuǎn)染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA,，推薦用玻璃纖維結(jié)合,，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸,，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子,。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）,。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在,，如皮膚,，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等,，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要,。

3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性

通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高,。此外,，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗,，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞,，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。

4.避免使用抗生素

Ambion公司推薦從細胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用抗生素,?？股貢诖┩傅募毎蟹e累毒素。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件,。這種情況下,，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到*轉(zhuǎn)染效果,。

5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑

針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同,，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關(guān)重要。

6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件

對大多數(shù)細胞,，看家基因是較好的陽性對照,。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平,。過多的siRNA將導(dǎo)致細胞毒性以至死亡,。

7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細胞,，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來,。