做過(guò)qPCR（熒光定量PCR）的小伙伴,，可能會(huì)遇到這樣的問(wèn)題，明明已經(jīng)按照文獻(xiàn)的方法,，照搬PCR引物,，可還是每次結(jié)果都不一樣。

其實(shí)原因有這么幾個(gè)：

有些小伙伴可能會(huì)說(shuō),，移液槍使用多么簡(jiǎn)單,，怎么可能不會(huì)用,？實(shí)際上，在使用移液槍?zhuān)貏e是微量移液槍的時(shí)候,，我們往往會(huì)長(zhǎng)期快速操作,，也就是說(shuō)在彈簧還沒(méi)來(lái)得及恢復(fù)的時(shí)候，我們已經(jīng)又按了一下了,。這樣可能導(dǎo)致的結(jié)果不用我多說(shuō),，首先可能會(huì)導(dǎo)致……指關(guān)節(jié)受傷。當(dāng)然,，這些只是其次,，最重要的是會(huì)影響移液量。

所以,，關(guān)愛(ài)拇指,，吸取液體時(shí)，保持1-2秒,，給彈簧一個(gè)緩沖,。當(dāng)然，在加模板的時(shí)候,，提高模板加樣量,，也可以盡可能減少每次加樣的誤差。

吸取液體的時(shí)候,，需要把槍頭插入凹液面底部,，而不是插到凹液面的側(cè)面。側(cè)面比較容易產(chǎn)生氣泡：

當(dāng)然,，你會(huì)說(shuō),，每次槍頭都插很深（莫名其妙覺(jué)得是在開(kāi)車(chē)），但是這樣的話(huà),，就很容易在槍頭上沾上液滴,，在微量的模板加樣時(shí)，很容易導(dǎo)致加樣量的誤差,。

二,、RNA的降解，也就是RNA完整性的問(wèn)題  

RNA的完整性,，一般體現(xiàn)在電泳過(guò)程中18S和28S的亮度上,，如果這兩個(gè)條帶的RNA亮度變低，甚至沒(méi)有,，就說(shuō)明RNA的完整性應(yīng)該會(huì)有損失,。（但實(shí)際上現(xiàn)在沒(méi)人去跑電泳）導(dǎo)致RNA完整性受損的原因有很多，比如：

包括鎂離子,，pH,，溫度,，紫外線(xiàn)，福爾馬林等等都會(huì)對(duì)你的RNA產(chǎn)生影響,。所以,，要處處小心。于是有人做了這樣的實(shí)驗(yàn),，就是對(duì)于RNA的降解,，有沒(méi)有什么方法可以降低RNA降解對(duì)于qPCR的影響。

他們分別分析了3`端和5`端的擴(kuò)增CT值,，以及長(zhǎng)片段和短片段的ΔCT,，發(fā)現(xiàn)RNA的完整性缺失與3`端和5`端沒(méi)多大關(guān)系，但是短片段會(huì)比長(zhǎng)片段擴(kuò)增效率更高,。所以,，qPCR引物設(shè)計(jì)的過(guò)程中，盡量把片段設(shè)計(jì)得短一點(diǎn),。

三,、抑制物，這點(diǎn)相對(duì)難解決               

在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或者PCR過(guò)程中都可能有抑制物,，這些抑制物,，比如Na離子，EDTA,，SDS,，酚，血紅素,，腐植酸等等,，都會(huì)對(duì)qPCR結(jié)果產(chǎn)生影響。具體體現(xiàn)在擴(kuò)增曲線(xiàn)里會(huì)是這樣：

實(shí)際上去除抑制劑也只能在抽提的過(guò)程中盡量洗脫掉抑制劑,，別的操作過(guò)程中其實(shí)也沒(méi)什么辦法（加促進(jìn)劑可能又會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定因素）,。

我們往往謹(jǐn)慎對(duì)待：引物、探針,、Ct 值等,，但也有一些小東西會(huì)被忽視，比如：ROX™,。也許很多同學(xué)的第一反應(yīng)是：總聽(tīng)人說(shuō)起 ROX™,，但它是什么？它在熒光定量 PCR 里起到什么作用呢,？

其實(shí)和 FAM™,、VIC™、SYBR™ Green 類(lèi)似，ROX™ 也是一種在 qPCR 反應(yīng)中能被 qPCR 儀檢測(cè)到的熒光染料分子,。但與其他染料不同,，ROX™ 是一種惰性參比染料，也就是說(shuō),，其熒光信號(hào)并不隨著 PCR 擴(kuò)增而增強(qiáng)。相反,，ROX™ 的熒光信號(hào)值在反應(yīng)中是基本保持不變的,。

四、ROXTM  有什么問(wèn)呢,？             

其實(shí),，在 qPCR 反應(yīng)中有許多反應(yīng)本身的物理因素會(huì)影響信號(hào)檢測(cè)，從而造成孔間數(shù)據(jù)的差異,。例如：PCR 反應(yīng)板本底信號(hào)不均一,，PCR 管蓋厚度有差異，同一反應(yīng)體系在分裝時(shí)出現(xiàn)了差異等因素,。ROX™ 能幫助我們通過(guò)均一化校正消除這些因素的誤差,，從而提高數(shù)據(jù)精確性。

五,、ROXTM  的工作原理,？             

請(qǐng)大家注意看板上的兩個(gè)孔，我們?cè)诿總€(gè)孔中加入「wan全等量」的樣本,，然后進(jìn)行擴(kuò)增,。很快，30 個(gè)循環(huán)完成了,。在每一個(gè)循環(huán)中,，我們的儀器都會(huì)讀取出一個(gè)熒光信號(hào)值。

理論上儀器檢測(cè)出這兩個(gè)孔的信號(hào)值應(yīng)該是wan全相同的,，因?yàn)閯傞_(kāi)始的時(shí)候樣品是wan全一樣的,。但實(shí)際上，由于移液器加樣存在誤差,，耗材孔間不同等一系列差異,，這兩孔檢測(cè)出的信號(hào)值并不相同。幸運(yùn)的是,，我們?cè)趦蓚€(gè)孔中都加了相同的 ROX™,，而我們的儀器也同時(shí)讀取了 ROX™ 的信號(hào)值。

可以看到,，ROX™ 信號(hào)和 qPCR 反應(yīng)熒光信號(hào)都有差異,。仔細(xì)思考大家會(huì)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)本身的這些物理差異會(huì)對(duì) ROX™ 信號(hào)和 qPCR 反應(yīng)的熒光信號(hào)造成同等程度的影響,。

重要的是,，我們的儀器會(huì)在每一個(gè)循環(huán)中檢測(cè)每一個(gè)反應(yīng)孔的這兩種信號(hào),，然后在反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)進(jìn)行均一化處理。結(jié)合儀器自身的一系列熒光校準(zhǔn)參數(shù),，最終您的數(shù)據(jù)精度會(huì)得到顯著提高,。順便提一下，最終這個(gè)值也就是我們所說(shuō)的 Rn 值,，也表示報(bào)告基團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光值,。

六、兩個(gè)關(guān)于ROXTM  的重點(diǎn)：          

第一,，除非有些特殊情況,，Applied Biosystems™ 提供給您的熒光定量預(yù)混液已經(jīng)包含了最佳濃度的 ROX™，因此您無(wú)需再額外添加,。

第二,，所有 Applied Biosystems™ 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 軟件是默認(rèn)檢測(cè) ROX™ 并使用均一化數(shù)據(jù)，這會(huì)幫您提高數(shù)據(jù)精確性,。如果您選用的試劑盒或者預(yù)混液不含 ROX™,，依據(jù)您對(duì)實(shí)驗(yàn)的精度的要求不同，您可以另外采購(gòu) ROX™ 摸索最佳濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn),，您也可以將參比熒光染料選項(xiàng)改為 None（無(wú)）,，放棄 ROX 校正。在沒(méi)有 ROX™ 存在的情況下,，我們建議選擇參比熒光為 None 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,。

好了，看看你的操作過(guò)程中是不是有這樣或者那樣的問(wèn)題,，看看你的擴(kuò)增曲線(xiàn)是不是有比較奇怪的變化,，然后，進(jìn)行改進(jìn)吧,。