目的基因的PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)原理

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法。它包括3個(gè)基本步驟：⑴變性：目的雙鏈DNA段在94℃下解鏈,；⑵退火：兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì),；⑶延伸：在Taq DNA聚合酶合成DNA的zui適溫度下，以目的DNA為模板進(jìn)行合成。由這3個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25~35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)10⁶倍,。

實(shí)驗(yàn)試劑

Taq酶  
相應(yīng)引物 
dNTP等

實(shí)驗(yàn)步驟

1.PCR反應(yīng)
 (1) 所用溶液融化后置于冰上,。
 (2) 依次混勻下列試劑：

25μl      10×PCR buffer

15μl      25mmol/L MgCl₂

25μl      4種dNTP

5μl       引物1

5μl       引物2

124μl     ddH₂O

1μl       Taq 酶  

     混勻后離心5秒種。      
   (3) 分成10管,，每管各加5μl模板DNA（約1ng）,，編號(hào)。
  (4) 混勻后離心5秒種,，PCR擴(kuò)增,。
  (5) 參數(shù)設(shè)定

2. 電泳

取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度,。

注意事項(xiàng)

1. PCR反應(yīng)非常靈敏,，操作應(yīng)盡量在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行。
2. 吸頭,、離心管應(yīng)高壓滅菌,，每次吸頭用畢應(yīng)更換，不要相互污染試劑,。
3. 試劑前,，應(yīng)短促離心10秒鐘，然后再打開(kāi)管蓋,，以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面,。