細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒的說明書

規(guī)格：50T
保存：-20℃保存,，一年有效,。C1052-2碘化丙啶染色液(20×)需避光保存。本試劑盒可4℃保存,，一個月內(nèi)有效,。
產(chǎn)品說明：
細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidium staining，即PI staining)方法進行細胞周期與細胞凋亡分析的檢測試劑盒,。 碘化丙啶(Propidium,，簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光,，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比,。細胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定,，然后根據(jù)DNA含量的分布情況,，可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假設(shè)G0/G1期細胞的熒光強度為1,，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2,，正在進行DNA復(fù)制的S期細胞的熒光強度為1-2之間。凋亡細胞由于細胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA片段化(DNA fragmentation)導(dǎo)致部分基因組DNA片斷在染色過程中丟失,，因此凋亡細胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染,，即熒光強度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰,，即凋亡細胞峰,。
細胞發(fā)生凋亡時，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮,、核碎裂,，產(chǎn)生凋亡小體，使細胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化,。在細胞凋亡的早期,，細胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化,。在細胞凋亡的晚期,，前向和側(cè)向光散射的信號均降低。因此可通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化觀察細胞凋亡情況,。
本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與細胞凋亡檢測,。如果用于組織的細胞周期與細胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細胞狀態(tài),，才可以進行檢測,。本試劑盒足夠檢測50個樣品，每個樣品的細胞數(shù)量可以為10-100萬,。
試劑盒組成：
試劑名稱 規(guī)格 
染色緩沖液 25mL 
碘化丙啶染色液(20×) 1.25mL 
RNase A (50×) 0.5 mL 
使用方法：（僅供參考）
1. 細胞樣品的準備：
a. 對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用,。用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液,，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞,。再次收集到離心管內(nèi),。1000g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞,。對于特定的細胞,，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力,。小心吸除上清,，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液,，以避免吸走細胞。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS,，重懸細胞,，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞,，小心吸除上清,，可以殘留約50微升左右的PBS，以避免吸走細胞,。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,，避免細胞成團。
b. 對于懸浮細胞：1000g左右離心3-5分鐘,，沉淀細胞,。對于特定的細胞,，如果細胞沉淀不充分,，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液,，以避免吸走細胞。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS,，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi),。再次離心沉淀細胞,，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS,，以避免吸走細胞,。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團,。
2. 細胞固定：加入1毫升冰浴預(yù)冷70%乙醇中,，輕輕吹打混勻，4℃固定2小時或更長時間,。固定12-24小時可能效果更佳,。1000g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞,。對于特定的細胞,，如果細胞沉淀不充分,，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力,。小心吸除上清,，可以殘留約50微升左右的70%乙醇,，以避免吸走細胞,。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細胞,。再次離心沉淀細胞,，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS,，以避免吸走細胞,。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團,。
3. 碘化丙啶染色液的配制：參考下表,，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液：
試劑名稱 1個樣品 6個樣品 12個樣品 
染色緩沖液 0.5mL 3mL 6mL 
碘化丙啶染色液(20×) 25μL 150μL 300μL 
RNase A (50×) 10μL 60μL 120μL 
Final volume 0.535 mL 3.21 mL 6.42 mL 
注：配制好的碘化丙啶染色液短時間內(nèi)可以4℃保存，宜當日使用,。
4. 染色：每管細胞樣品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液,，緩慢并充分重懸細胞沉淀,， 37℃避光溫浴30分鐘。隨后可以4℃或冰浴避光存放,。染色完成后宜在24小時內(nèi)完成流式檢測,，能在當日完成流式檢測,。
5. 流式檢測和分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況,。采用適當分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析,。