濟南PCR實驗室裝修工程 設(shè)計規(guī)劃

PCR實驗室污染主要是下面四個方面

(一) 標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時,，由于密封不嚴溢于容器外,，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中,，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,，導致彼此間的污染。

(二) PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中,，由于加樣槍,、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染,。

(三) PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中主要的常見污染問題,。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性,。

還有一種容易忽視,，可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管,，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染,。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題,。

(四) 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室,，這個問題也比較常見，因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高,，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,，其污染可能性也很大,。

污染的監(jiān)測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測,，考慮有無污染是什么原因造成的污染,，以便采取措施，防止和消除污染。

對照試驗

1,、陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志,。陽性 對照要選擇擴增度中等,、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,，如以重組質(zhì)粒為陽性對照,，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定,，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照,。

2,、陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,；被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照,。②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增,，以監(jiān)測試劑是否污染,。

3、重復性試驗

4,、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增

防止污染的方法

進行PCR操作時,，操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程，大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn),。

(一) 劃分操作區(qū)：目前,，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)*閉管操作,，但無論是否能夠達到單人單管,，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：

1. 試劑準備區(qū),。

2．標本制備區(qū),。

3. PCR擴增區(qū)及分析區(qū)。

各工作區(qū)要有一定的隔離,，操作器材,，要有一定的方向性。如：試劑準備→標準制備→PCR擴增區(qū)及分析區(qū),。

切記：任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū),。

(二) 分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜,、裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：

1．PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水,；

2．引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制；

3．引物和dNTP應(yīng)分裝儲存,，分裝時應(yīng)標明時間,，以備發(fā)生污染時查找原因。

(三) 實驗操作注意事項

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因,，樣品間的交叉污染也是原因之一,。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真,，在樣品的收集,、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液,，立即更換手套,；

2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,，吸頭不要長時間暴露于空氣中,，避免氣溶膠的污染；

3. 避免反應(yīng)液飛濺,，打開反應(yīng)管時為避免此種情況,，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

4. 操作多份樣品時,，制備反應(yīng)混合液,，先將dNTP、緩沖液,、引物和酶混合好,，然后分裝，這樣即可以減少操作,，避免污染,，又可以增加反應(yīng)的精確度；

5. 后加入反應(yīng)模板,，加入后蓋緊反應(yīng)管,；

6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性,，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性,；

7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，z-ui好使用可替換或高壓處理的加樣器,。如沒有這種特殊的加樣器,，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該，不能交叉使用,，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū),；

8. 重復實驗，驗證結(jié)果,，慎下結(jié)論,。

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