醫(yī)院病理科PCR實驗室設(shè)計規(guī)劃新建擴(kuò)建改造

PCR實驗室原則上為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū),、擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)四個單獨的工作區(qū)域并設(shè)有走廊,，各工作區(qū)域應(yīng)設(shè)緩沖間，工作區(qū)與緩沖間宜安裝連鎖裝置,。不同功能的工作區(qū)應(yīng)是分隔獨立的,，各工作區(qū)有明顯的標(biāo)志，不能直通,，如果緊密相連,，需安裝物品傳遞窗。

前兩區(qū)為擴(kuò)增前區(qū),，后兩區(qū)為擴(kuò)增后區(qū),，擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開。實驗材料,、試劑,、記錄紙、筆,、清潔材料等,，只能從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)，即從試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣品制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),，不得逆向流動,。實驗室的氣流也應(yīng)從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)，不得逆向流動,。各工作區(qū)頂部應(yīng)安裝紫外燈,，紫外燈的波長為254nm，每20㎡一支40W的紫外燈,。

1、樣本間交叉污染：

收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖,；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌,；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散,，相互交叉污染,。

2、實驗試劑污染：

主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中,，由于移液器,、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染,。 加樣過程中,，因為 PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃,，但這個過程也是充滿了污染的風(fēng)險的,。

3、擴(kuò)增產(chǎn)物污染：

大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋,，這是 PCR 反應(yīng)中主要zui常見的污染問題,。因為 PCR 產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限,，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染,，就可形成假陽性。

4,、克隆質(zhì)粒污染：

作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢,。

按照實驗室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）,。

5,、嚴(yán)格執(zhí)行各區(qū)功能劃分：

試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備,，以及離心管,、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA,、DNA）提取,、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作,，應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護(hù)設(shè)備,、個人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。

擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成,、DNA擴(kuò)增及檢測,。

擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定,，如雜交、酶切電泳,、變性高效液相分析,、測序等。

試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本制備區(qū)和擴(kuò)增區(qū)內(nèi)的實驗用品,，包括移液器等器具應(yīng)，空氣,、物品流向依次為：試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū),、產(chǎn)物分析區(qū),，不可逆行。

6,、清潔的實驗用品：

實驗室自配試劑（去離子水,、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖,、反應(yīng)管等實驗耗材應(yīng)一次性使用,。

7、正確的實驗操作：

實驗應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行,，工作臺內(nèi)應(yīng)放置PCR的微量離心機(jī),、各量程的移液器和其他必須物品。

實驗的過程中選擇合適尺寸的手套并能及時更換,，在進(jìn)出不同實驗區(qū)域或進(jìn)行模板操作后都應(yīng)更換實驗服,、帽子及手套，以避免不同實驗區(qū)交叉污染,。

裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開之前應(yīng)先瞬時離心,，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風(fēng)險,；謹(jǐn)慎開啟反應(yīng)管,，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染。

吸加試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范要求進(jìn)行,，遵守“慢吸快打"原則,，盡量一次性完成，忌多次抽吸,，以避免氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染,。

PCR試劑建議小量分裝，以減少反復(fù)凍融,、重復(fù)取樣次數(shù),；多樣本PCR反應(yīng)時,，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，后加入樣本核酸,，請勿同時開蓋,，盡量保證單人單管，實現(xiàn)*閉管操作,。

實驗試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同處,。

PCR擴(kuò)增實驗完成后及時將反應(yīng)管取出,，用一次性手套將產(chǎn)物反應(yīng)管包裹丟棄，保證管蓋緊閉,。

8,、規(guī)范的實驗設(shè)計：

應(yīng)遵循實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實驗中設(shè)立陽性對照,、陰性對照和空白對照,，全程質(zhì)控實驗過程，驗證PCR反應(yīng)的可靠性,，并協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性,。

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