進(jìn)口PCR儀已經(jīng)成為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè),、司法科學(xué)、生物技術(shù),、環(huán)境科學(xué),、微生物學(xué)、臨床診斷,、流行病學(xué),、遺傳學(xué)、基因芯片,、基因檢測(cè),、基因克隆、基因表達(dá)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種儀器,。進(jìn)口PCR儀在操作中常會(huì)遇到哪些問(wèn)題呢,？該如何解決呢？
　　
　　1,、PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤,，這大多是由于聚合酶忠實(shí)性低或者循環(huán)數(shù)太多，這時(shí)需要使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶,，同時(shí)降低循環(huán)數(shù),。此外,，四種dNTP的濃度不同也會(huì)出現(xiàn)該問(wèn)題，此時(shí)應(yīng)制備新的濃度相同的dNTP混合物,。
　　
　　2,、PCR跑膠，目的條帶很亮,，但是邊沿不清楚,，前后有拖尾現(xiàn)象。出現(xiàn)這樣的問(wèn)題,，則需要進(jìn)行細(xì)致的分析,，因?yàn)橐鹪搯?wèn)題的可能很多?？上葯z查是否模板質(zhì)量問(wèn)題,，如有降解等，模板應(yīng)避免反復(fù)凍融,。也有可能是抽提RNA時(shí)有污染,，則需要重新抽提RNA。此外,，也可能是非特異性擴(kuò)增引發(fā)該問(wèn)題,，可提高退火溫度，少循環(huán)次數(shù),。電泳緩沖液時(shí)間太長(zhǎng),，ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時(shí)電壓太高,、電泳液過(guò)久沒(méi)換,，電泳膠臟了等都可能引發(fā)該問(wèn)題。如果不是由上述原因引起,，則進(jìn)一步檢查加樣量是否過(guò)大,，制膠過(guò)程中膠孔是否制好，EB是否沖洗干凈,、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等,。也需考慮是否擴(kuò)增的條件不合適。針對(duì)具體原因再采取相應(yīng)的措施,。
　　
　　3,、PCR產(chǎn)物何時(shí)需要用凝膠純化，何時(shí)不需要,？當(dāng)凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶時(shí),，則不需要使用凝膠純化。當(dāng)可見(jiàn)其他雜帶時(shí),，則可能是積累了大量引物的二聚體,，在克隆前需要做凝膠純化,。
　　
　　4、如果實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有回收到目的片段,，則需要繼續(xù)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),。包括涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù),，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率、用pGEM-T或pGEM-TEasy載體,，連接pGEM-T正對(duì)照,，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞，按照的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行,。
　　
　　5,、實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增該怎么辦？這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染的表現(xiàn),，應(yīng)通過(guò)檢查排除污染源,。首先考慮是否為試劑污染,，可將試劑分裝好直接置于進(jìn)口PCR儀中擴(kuò)增進(jìn)行判斷,。其次要考慮是否為實(shí)驗(yàn)室污染，可更換所用的移液器,、吸咀管（離心管）等,，將試驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的環(huán)境中，判斷是否為實(shí)驗(yàn)室污染,。如果是則需要對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)器材*清洗處理,，保持良好的通風(fēng)、清潔等,。此外,，還要考慮是否為采樣污染，一般表現(xiàn)為一批結(jié)果陽(yáng)性率很高,，一批結(jié)果陽(yáng)性率又下降很多,，如此反復(fù)。解決方法為盡量使用一次試管及吸咀取樣,。
　　
　　6,、實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性擴(kuò)增該怎么辦？首先要考慮是否為儀器故障,，儀器應(yīng)正常運(yùn)轉(zhuǎn),，尤其要注意加熱溫度及各管間的差異是否符合實(shí)驗(yàn)要求，是否出現(xiàn)誤差等,。其次要考慮是否為試劑失效或無(wú)效引起,，使用有效的試劑,。