液相色譜儀檢測分析過程中，硅膠色譜柱上被吸附的樣品成分累積到一定程度時,，就開始形成新的固定相,。新的檢測物質(zhì)能與殘留雜質(zhì)作用形成一定的分離機理,，從而導(dǎo)致保留時間波動，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,。隨著時間的積累,，色譜柱的反壓就會超過泵所能承受的zui大壓力，使色譜柱無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積,。
再生被污染的液相色譜柱的關(guān)鍵是了解污染物的性質(zhì)并且找到適當?shù)娜軇﹣砬宄?。如果污染是因為重?fù)進樣時強保留物質(zhì)的累積引起的，可用90～100%較強的溶劑沖洗20個體積可以清除污染物,。例如,，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴,、四氫呋喃,。如果使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑,，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖液沉淀,，這樣會導(dǎo)致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞,、泵泄漏,、活塞損傷或進樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖流動相（即把緩沖液換成水）沖洗5～10個體積以后才更換強溶劑,。
有時候,，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要使用更強的溶劑或者多重溶劑來清洗柱子,。一般來說,，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加,，經(jīng)常zui后一個溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯）,，可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。在使用多重溶劑時,，須保證每個溶劑都能與下一個溶劑互混,。清洗過程要結(jié)束時，必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng),。例如,，異丙醇是一個非常好的作為中間步驟的溶劑，因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶,。但是異丙醇粘度非常大,，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。當然,，如果使用紫外檢測器的話,，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收,，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。
硅膠鍵合柱常用的緩沖溶液可使用以下溶劑：100%甲醇,、100%乙腈,、75%乙腈－25%異丙醇、100%異丙醇,、100%二氯甲烷,、100%正己烷。用二氯甲烷或正己烷以后,，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑,，每種溶劑至少沖洗10個柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱,，可以用1～2ml/min的流速來沖洗,，要回復(fù)原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗,，可以跳過中間步驟,。中間步驟可使用異丙醇，然后用沒有緩沖的流動相,，zui后回復(fù)起始流動相配置,。四氫呋喃是另外一種教常用的去除污染的溶劑。如果色譜柱被嚴重污染,，可以二甲基亞砜或者二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱,。成功再生反相柱子是一個非常耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度洗脫系統(tǒng)操作,；還有一個問題是清洗過程中是否可以反沖HPLC色譜柱,，因為大多數(shù)強保留的污染物都會累積在柱頭，把柱子反過來可以縮短污染物被沖出柱子的移動距離,?？紤]到裝填柱子的穩(wěn)定性，現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的高壓裝填的,，因此他們的柱床應(yīng)該不會受到反方向流速的影響,。但是，如果頭上的燒結(jié)比尾部的燒結(jié)孔徑大的話,。例如尾部燒結(jié)的孔徑是2μm,，通常能夠留住平均5μm孔徑里的填料。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線的zui小粒徑時,，有些填料能穿過這些縫隙而流出色譜柱，這樣會導(dǎo)致空白出現(xiàn),。
清洗色譜柱的頻率主要看有多少強保留物質(zhì)流經(jīng)色譜柱,，因為反相柱有時候在分辨率消失或者鬼峰出現(xiàn)前能承受很大的污染,，使用者經(jīng)常會等到出現(xiàn)了異常情況才開始注意。然而,，污染物過多的累積會導(dǎo)致清洗柱子的難度加大,。所以，經(jīng)常用雜質(zhì)較多的樣品上樣時,，應(yīng)當有規(guī)律地清洗柱子,。
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