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熒光定量PCR儀 傳染病診斷儀

型號(hào)：GR/TL988

TL988型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀應(yīng)用領(lǐng)域臨床疾病診斷:各型肝炎,、艾滋病,、禽流感、結(jié)核,、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià);地中海貧血,、血友病、性別發(fā)育異常,、智力低下綜合癥,、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測;腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷;遺傳基因檢測實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。

北京熒光定量PCR儀動(dòng)物疾病檢測:禽流感、新城疫,、口蹄疫,、豬瘟、沙門菌,、大腸埃希菌,、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等,、炭疽芽孢桿菌,。

食品安全:食源微生物、食品過敏源,、轉(zhuǎn)基因,、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。

科學(xué)研究:醫(yī)學(xué),、農(nóng)牧,、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。

應(yīng)用行業(yè):各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu),、大學(xué)及研究所,、CDC、檢驗(yàn)檢疫局,、獸醫(yī)站,、食品企業(yè)及乳品廠等。

北京熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR的出現(xiàn),，大大的地簡化了定量檢測的過程,，而且真正實(shí)現(xiàn)了定量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn),，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng),。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速,、重復(fù)性好,、靈敏度高、特異性強(qiáng),、結(jié)果清晰。隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合,，熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)檢測及其他各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將更加廣闊,，令人欣喜。盡管如此我們也應(yīng)清晰認(rèn)識(shí)到,，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)在我國各個(gè)研究領(lǐng)域的應(yīng)用并不多見,，這就需要我國學(xué)者迎頭趕上，使FQ-PCR技術(shù)更充分地推廣，以推動(dòng)研究工作的快速發(fā)展,。

實(shí)驗(yàn)步驟:

樣品RNA的抽提折疊

①取凍存已裂解的細(xì)胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lv仿,，蓋緊管蓋,。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘,。離心后混合液體將分為下層的紅色酚 仿相，中間層以及無色水相上層,。RNA全部被分配于水相中,。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘,。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊,。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),，清洗RNA沉淀,。混勻后,，4℃下7000rpm離心5分鐘,。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘,。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí),，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解,，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用,。

RNA質(zhì)量檢測折疊

1)紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,，測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml,。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為:A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml,。具體計(jì)算如下:

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul,，1:100稀釋至495μl的TE中,，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后,，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為:

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,，比值范圍1.8到2.1,。

2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃,，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M),。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板,，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液,。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi),，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米,。

②準(zhǔn)備RNA樣品

取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液,，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml,。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min,，隨后將樣品加入上樣孔,。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm,。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶,，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成,。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成,。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散,。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。