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北京北信科遠儀器有限責任公司
主營產(chǎn)品： 搖擺式脫色搖床,實驗室電子分析天平,一體涂層測厚儀 |
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主營產(chǎn)品： 搖擺式脫色搖床,實驗室電子分析天平,一體涂層測厚儀 |
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2016-1-29 閱讀(752)
盡管單次使用已非全新的理念,，并且在囊式過濾器和貯存袋之類的產(chǎn)品中已經(jīng)成為標準操作,，當下單次使用工藝比常規(guī)的生產(chǎn)方法更為復雜，由集成模塊構成——尤其是在新設備中——通常替代了原來的不銹鋼設備,。
目前單次使用技術被*是可以減少交叉污染的風險，降低投資風險,，具備更大的靈活性,，可以為試驗用藥品提供具有成本效益的產(chǎn)品開發(fā)方案。單次使用生物反應器問世尚未超過20 年,，考慮到諸如此類的因素,，可以認為這種技術在如此短的時間之內呈現(xiàn)出迅猛發(fā)展，推陳出新的發(fā)展態(tài)勢,。
當前,，得益于單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)領域中菌株的優(yōu)化和培養(yǎng)基的改善，分批補料式哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的生產(chǎn)效率已經(jīng)顯著提升,。生物量濃度已經(jīng)從1-3 g/L 增至7-10 g/L,，因此促進了較小規(guī)模的生產(chǎn)容器的運用，不過與此同時,，也讓下游的工藝面臨更多的難題,。[1,2] 產(chǎn)量更大、濃度更高,，深層過濾器難以進行處理,。對大于500 L 的體積,，要降低生產(chǎn)成本并減少浪費，離心機的使用*,。
運用即用型澄清系統(tǒng),，高達2,000L 的體積都可實現(xiàn)單次使用處理，這樣商業(yè)可行的方案,，在一個步驟內就能替代離心機和深層過濾器,。
收集技術
高產(chǎn)品滴度源自于細胞密度的增加而非每一種細胞單位生產(chǎn)率的提升，所以固體量會明顯增大,，常規(guī)的收集技術難以應對,。
目前，zui廣泛應用的單次使用收集技術是深層過濾,。不過,，生物量濃度較高的情況下，深層過濾器在負載量較低時就會堵塞,。較高的污染物濃度也讓深層過濾器對批次變異更為敏感,，因此為了彌補過濾能力的波動， 過濾器的面積會過大（ 多達50%）,。目前可以使用離心之類的單次使用細胞去除方案,，但是生產(chǎn)能力較低，導致成本較高,，浪費較大,。
不過，一種新替代方案已經(jīng)出現(xiàn),。賽多利斯斯泰迪生物技術公司的產(chǎn)品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術,，用于高細胞密度的動物細胞培養(yǎng)的收集。這種即用型的澄清系統(tǒng)得益于血漿成分分離行業(yè)的啟發(fā),，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎,，該系統(tǒng)性能穩(wěn)定、易于使用,、快速,、可以靈活地放大。
該系統(tǒng)可以處理高達2,000 L 的體積,，因此能夠在一個步驟之內同時替代離心機和深層過濾器,。關鍵因素在于進料流中添加了高孔隙度的助濾劑，增加了濾餅的滲透性,，防止過濾器出現(xiàn)堵塞,。
摻漿過濾
很長時間以來， 摻漿過濾中運用硅藻土（DE）之類的助濾劑來提升過濾器的性能,。[3] 硅藻土（DE,， 或稱為diatomite ,、kieselgur/kieselguhr） 是一種天然存在的硅質沉積巖，質軟,，通常粒徑為10-200 μm,。DE 是由硅藻（微小的單細胞藻類）化石的殼或外骨骼構成，具有高孔隙率的結構和惰性特征,，通常在生物技術行業(yè)的收集階段用于深層過濾器,。加入到細胞培養(yǎng)基中的DE 具有雙重作用：濾除亞微米的顆粒，并形成一個具有滲透性的濾餅,，改善過濾器的處理量,。這種細小的助濾劑顆粒形成無數(shù)微小通道，懸浮的雜質被截留,，而澄清的液體可以不受阻礙地通過,。
BFF 的工作原理
現(xiàn)在有眾多產(chǎn)品的生產(chǎn)運用了BFF 系統(tǒng)，其中包括靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）,、白蛋白和一些凝血因子,，所基于的原理包括選擇性pH 誘導沉淀、離子強度,、添加乙醇以及溫度的變化,。[4-6] 沉淀物的去除采用的是DE 強化的深層過濾。
實際操作過程中,，需要進行澄清操作的生物工藝流體中固體的濃度過高時,，流體將不能透過過濾器表面的濾餅（圖1）。添加DE 之類的助濾劑之后,，形成的濾餅更具滲透性,，可以防止堵塞。所需DE 的量取決于顆粒的濃度,。為了獲得理想的結果并使用盡可能少的DE，建議對細胞培養(yǎng)液進行預處理,?？梢蕴砑幽蹌┗蛘呖梢越档蚿H 值，從而形成聚集體,，其體積大至不能進入濾餅層,。這樣，濾餅可以保持滲透性,，而DE 與生物量的比例可以降低為1:4,。
賽多利斯斯泰迪生物技術公司的產(chǎn)品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術，用于高細胞密度的哺乳動物細胞的收集,，該技術得益于血漿成分分離行業(yè)的啟發(fā),，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎,。（圖片有賽多利斯公司提供）圖1：加入硅藻土（左）的動態(tài)摻漿過濾和常規(guī)的過濾（右）。
DE 有各種級別,，純度和滲透性各異,，適合不同的應用，而賽多利斯斯泰迪生物技術公司選擇了Celpure C300 作為哺乳動物細胞培養(yǎng)操作中zui合適的助濾劑,。
Celpure C300 特別針對制藥領域設計,，采用生產(chǎn)工藝制造，是一種高純度的DE,，具有更出色的操作穩(wěn)定性,。在多種培養(yǎng)基、介質和活力條件下進行的測試發(fā)現(xiàn),，的DE 濃度為細胞濕重（WCW）的40-50%,，如果pH 降低至5，這一比例還可以減小至20-30%,。
低pH 值沉淀的優(yōu)勢
對于微孔過濾和深層過濾之類的細胞去除技術,，性能的差異可以歸結于低pH 值水平（pH 4.3-5.5）下較小顆粒的沉降。[4-5] 細胞碎片,、DNA 以及宿主細胞蛋白在酸性條件下的溶解性都會降低,。6 另外，降低pH 值之后可以形成較大的顆粒,，原來在pH 7.0 時存在的亞微顆粒會*消失（圖2）,。與此類似，較低的pH 值也有利于BFF 的操作：所測試的細胞培養(yǎng)上清液在酸性條件下時,，濾出液比中性條件時更為澄清（未顯示數(shù)據(jù)）,。
圖2：三種不同的收集方式（綠色=pH 7.0，紅色=pH 5.0,，）下,，不含細胞的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞培養(yǎng)上清液的平均粒徑分布。利用Mastersizer 2000（Malvern Instruments 公司）記錄數(shù)據(jù),。
人們認為,，DE 可以捕獲大顆粒（>0.4μm），因此總體的滲透性和過濾能力會降低,。通過增加DE 的濃度,，有可能改善其性能，截留小顆粒,，同時不會喪失所需的濾餅滲透性,。另外，雖然大部分抗體在酸性條件下是穩(wěn)定的,，但是有一些抗體可能會出現(xiàn)共沉淀,。[5-6] 實驗室的BFF 測試在低pH 值條件時,，可以獲得85% 以上的回收率（未顯示數(shù)據(jù)）。
實際應用
細胞培養(yǎng)收集過程中BFF 已經(jīng)作為一種替代方法得到廣泛應用,，因此賽多利斯斯泰迪生物技術公司與RentschlerBiotechnologie 公司合作,，評估這種技術作為單次使用技術，替代離心機和深層過濾器的可能性,。[7] 測試中采用了600 L 的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)過程,，對條件進行了優(yōu)化，評估了BFF 技術的升級放大,。
Sartoclear Dynamics 是專門針對藥品生產(chǎn)過程中哺乳動物細胞培養(yǎng)的澄清操作而設計的產(chǎn)品,，利用這種設備在一系列細胞株和培養(yǎng)介質中獲得了測試結果。
運用高細胞密度的中國倉鼠卵巢（CHO） 細胞分批補料式培養(yǎng)（17.6×106 cells/mL,，95% 的活力,，1000L），進行了試驗生產(chǎn)測試,。[8] zui大的BFF 測試為600 L,，pH 5.0（WCW = 8%）。在放大試驗中,，在通用型不銹鋼支架中使用了總過濾面積為1.61 m2的七個工藝放大模塊,。
過濾器的過濾盒由兩層聚乙烯過濾板組成，中間為DE 和生物量,。600L的收集液中加入Cellpure C300 DE（12kg）,，預填充DE 袋通過無塵適配器與混合袋連接，迅速安全地轉移DE,。溫和混勻5 分鐘之后,，DE 的粉末溶于細胞懸浮液中；另外,，在過濾前,，對所獲得的混合物調節(jié)pH 至5.0，以140 rpm 的速度混合2 小時,。
圖3 所示為操作過程中的壓力增加情況,。當壓力值達到1.3 bar 時，過濾過程結束,，初始收集液已經(jīng)過濾。在整個過程中保持了大約為300 L/m2/h 的快速且穩(wěn)定的流速,，并且總體的處理能力達到了311L/m2,。在過濾過程中，澄清的收集液流具有很低的濁度水平（5–8 NTU）,。中和之后,，zui終的液體具有41 NTU 的濁度,，這個數(shù)值相當高，可能的原因在于未能充分調節(jié)中和緩沖液的用量,。
在一項小規(guī)模的平行測試中,，改良中和步驟之后可以防止?jié)岫鹊脑黾印Ｕ陂_發(fā)的一種即用型整合工藝模塊,，可以讓pH 值的在線調節(jié)實現(xiàn)可控,。例如，IgG1 的回收率目前為85%（圖3）,，今后,，通過優(yōu)化中和步驟，改進過濾后沖洗,，mAb 的回收率將有望進一步得到提升,。在整個工藝過程內對宿主細胞蛋白質和DNA 之類的污染物進行了監(jiān)控，在zui終的液體內（緩沖液沖洗以及中和之后）,，這些污染物的濃度分別從841 和13.8 mg/ml 降低至629 和5.0 mg/ml,。
圖3：七個過濾器模塊中，降低pH（5.0）的情況下DE 摻漿過濾試驗放大的結果,。左：過濾性能,、壓力（bar）、流量（L/m2）以及過濾過程中的濁度,。右：IgG1 的回收,，在初始收集液、無緩沖沖洗的收集液（液1）,、有緩沖沖洗（液2）以及中和之后的收集液（液3）中進行測量,。
實驗結果
BFF 的試運行試驗證實了此前實驗室中觀察到的結果：DE 加入到初始的細胞培養(yǎng)上清液之后，將pH 降低至5.0,，這樣的條件之下在過濾性能,、沖洗和污染物去除方面可以獲得的結果。此外,，只需運用七個過濾模塊,，就可以在1 小時之內對600L 的收集液進行處理。因為模塊座可以容納多達33 個的模塊,，可以預計,，高達3,000L 的收集體積可以同時進行過濾。因此,，運用這樣的方法,，在單次使用的大規(guī)模裝置內，可以對初始的高密度細胞培養(yǎng)收集液實現(xiàn)的澄清操作。
總結
測試的目的是為了證實一種新穎的單次使用收集方法,，對于高密度的哺乳動物細胞培養(yǎng)具有普遍的適用性,，測試中采用了不同的細胞株和培養(yǎng)條件下的初始收集液，確定了DE 作為助濾劑的濃度,。此外,，在低pH 條件下，發(fā)現(xiàn)助濾劑的量可以減少50%,。
與沉淀過程結合使用時,，研究中的單次使用澄清系統(tǒng)穩(wěn)定可靠，無需再使用離心機,，其結果穩(wěn)定一致,，該系統(tǒng)易于操作、快速,、可以在線放大,，可以將兩步驟的細胞收集操作轉變?yōu)榈膯尾襟E操作，節(jié)約了時間和資金,。
BFF 等類似可以實現(xiàn)放大的技術彌補了單次使用產(chǎn)品市場中zui大的空白之一,。當前單次使用生物反應器的標準體積設定為2000 L，如此龐大的體積,，不再需要離心機來去除細胞,，這對于生物制藥行業(yè)而言是巨大的技術進步，構建了一個真正的單次使用過程,，帶來了的靈活性,，顯著地降低了資金投入。Sartoclear Dynamics 這種產(chǎn)品特別針對cGMP 工藝設計,，由單次使用預填充袋組成,，其中含有超純級別的硅藻土，可以在0.5-10 kg 的范圍內選擇,。無塵粉末轉移裝置配備有快速連接適配器,，DE可以直接與細胞培養(yǎng)液混合。這種多孔的助濾劑可以防止過濾器堵塞,，另外因為該系統(tǒng)內生物量和助濾劑一直保持穩(wěn)定的比例,，過濾器的性能則可以連續(xù)穩(wěn)定且達到狀態(tài)，用戶因此受益,。BFF能夠以高流速對非常稠密的初始細胞收集液進行澄清操作,，因此具有經(jīng)濟效益并且提升了生產(chǎn)力。(end)北京富瑞恒創(chuàng)科技有限公司,。
