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島津原子力顯微鏡在細(xì)胞及分子生物學(xué)的研究進(jìn)展
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原子力顯微鏡作為一種三維形貌觀察工具，不僅具備超高分辨率,，而且支持在液體環(huán)境下工作,，是一種理想的生命科學(xué)/醫(yī)學(xué)觀測設(shè)備,。除了形貌觀察外,，原子力顯微鏡還可以對多種表面屬性進(jìn)行定量觀測。例如,，基于力學(xué)測試的表面機(jī)械性能測試,。這些性能為原子力顯微鏡應(yīng)用于細(xì)胞和生物分子研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
01 iPS干細(xì)胞研究
干細(xì)胞的研究一直受制于供體細(xì)胞很難獲得,，而且相關(guān)實(shí)驗(yàn)的倫理風(fēng)險也不容忽視,。因此2007年發(fā)明的誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞(iPS)技術(shù)成為理想的胚胎干細(xì)胞替代技術(shù)。iPS細(xì)胞在形態(tài),、基因和蛋白表達(dá),、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力,、類胚體和畸形瘤生成能力,、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。但是iPS轉(zhuǎn)化過程中,，會有一定的幾率發(fā)展為癌細(xì)胞,。不同體細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞成瘤性有差異。因此,，如何篩選安全型iPS細(xì)胞是該技術(shù)能夠進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,。
可以使用原子力顯微鏡對未分化的iPS細(xì)胞和HeLa細(xì)胞進(jìn)行觀察比較,。HeLa細(xì)胞是一種被廣泛使用的癌變細(xì)胞，因此可以和iPS細(xì)胞進(jìn)行對比觀察,。
上圖顯示了SPM形狀圖像(a)HeLa細(xì)胞和(b)iPS細(xì)胞,。用光學(xué)顯微鏡觀察到的相應(yīng)相位差圖像分別顯示在(c)和(d)中。圖中箭頭所示位置處的截面形狀輪廓如(e)和(f)所示,。
從細(xì)胞形態(tài)上來看,，HeLa細(xì)胞呈圓頂形，表面隆起比較高,，約7um,；而iPS細(xì)胞呈扁平狀且細(xì)胞間粘附呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞高約1.7um,。仔細(xì)觀察細(xì)胞之間的邊界,，可以看出HeLa細(xì)胞之間的邊界呈凹陷狀，而iPS細(xì)胞之間的邊界是凸起的,，而且呈網(wǎng)絡(luò)狀,。據(jù)此可分析得知這兩種細(xì)胞各自的細(xì)胞間粘附具有差異，且HeLa細(xì)胞之間的粘附較弱,，而iPS細(xì)胞之間的粘附較強(qiáng),。
除了形貌觀察外，原子力顯微鏡還可以通過力學(xué)測量獲得細(xì)胞表面的機(jī)械性能,。如下圖所示,，用探針針尖壓觸細(xì)胞表面，通過對探針獲得的力反饋分析樣品各類機(jī)械性能,。
使用彈簧常數(shù)為0.15N/m的OMCL-TR800PSA探針，在培養(yǎng)液環(huán)境中對活細(xì)胞進(jìn)行測試,。對細(xì)胞的最終壓力(排斥力)為2.5nN,。通過比較從探針與樣品接觸的位置到達(dá)到2.5nN的力的變化，確定樣品的硬度,。
(a)和(b)顯示了SPM觀察到的HeLa和iPS細(xì)胞的細(xì)胞形狀圖像,，(c)和(d)顯示了相應(yīng)的ZX斷面圖像，是從樣品豎截面方向看時在(a)和(b)中箭頭所示的X線位置處施加到探針的力的圖像,。圖中上方為測量起點(diǎn),，下方白色虛線為壓觸終點(diǎn)，顯示了樣品截面形狀輪廓,。
在ZX圖像中,，探針與樣品接觸后檢測到力的位置以黃色到紅色的顏色顯示。這表明探針對細(xì)胞的變形,，所以可以理解為較大量的細(xì)胞變形顯示出細(xì)胞的較軟部分,?？梢詮募?xì)胞變形量了解硬度。(c)中的HeLa細(xì)胞顯示出均勻的變形,，但相比之下,，在(d)中的iPS細(xì)胞中，細(xì)胞體較軟,，細(xì)胞間粘附區(qū)較硬,。
分析結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞表面硬度比較均勻,，軟硬部分差別不大,，而iPS細(xì)胞主體較軟，細(xì)胞間粘附區(qū)較硬,。
02 DNA雙螺旋的高分辨觀察
DNA是經(jīng)常會被觀測的一種樣品,，使用基于調(diào)幅的輕敲/動態(tài)模式，一般只能看清鏈狀結(jié)構(gòu),。
液體環(huán)境下輕敲模式掃描DNA鏈
提高液體環(huán)境中的分辨率的辦法就是使用調(diào)頻模式替代調(diào)幅模式（輕敲/動態(tài)模式）,，完美應(yīng)對了生物樣品的測試需求。
傳統(tǒng)的調(diào)幅模式檢測在自由振動和受迫振動下同一頻率處的振幅變化,。這種模式受懸臂梁振動質(zhì)量因子（Q值）的影響非常大,，在液體環(huán)境中，因?yàn)橐后w對懸臂梁的粘滯阻力,，導(dǎo)致Q值急劇降低,，從而使分辨率變差。而調(diào)頻模式是檢測在自由振動和受迫振動下維持振幅不變時頻率的偏移,，在此模式下,，分辨率受Q值的影響較小，因此在液體中依然可以保持原子/分子級別的高分辨率,。而使用調(diào)頻模式,，可以對緩沖溶液或者培養(yǎng)液環(huán)境下的生物大分子進(jìn)行超高分辨的觀測，獲得接觸模式或者輕敲模式無法達(dá)到的超高分辨率,。
同樣是觀察DNA雙螺旋鏈,，使用調(diào)頻模式，可以清晰地分辨雙螺旋結(jié)構(gòu),，雙螺旋結(jié)構(gòu)形成的大溝小溝結(jié)構(gòu)也非常明顯,。
更細(xì)致地觀察一個螺距，還可以分辨表面的堿基數(shù)目,。
對相鄰兩個螺旋的剖面圖進(jìn)行分析,，觀察到的堿基數(shù)量與理論值完全符合。這說明調(diào)頻模式在液體環(huán)境中,，對柔軟的生物樣品觀察,，依然可以達(dá)到基團(tuán)級別的分辨率,。
03 外泌體觀察
外泌體和微泡是醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)的前沿研究熱點(diǎn)。然而,，對于它們的三維形態(tài)和膜的物理性質(zhì)還有許多方面的認(rèn)識尚不清楚,。外泌體因?yàn)?/span>其單層膜的性質(zhì)，所以非常軟,，對使用原子力顯微鏡測試提出了極高的要求,。
我們用原子力顯微鏡觀察了鹽溶液中的兩類外泌體并對其膜進(jìn)行了表征。
以上兩幅圖就是不同尺寸的外泌體,，其外徑從20nm到140nm不等,，表面極其柔軟，楊氏模量一般只有幾千Pa,。
原子力顯微鏡作為一種傳統(tǒng)意義上的材料學(xué)表面分析工具,，隨著其技術(shù)的不斷迭代發(fā)展，已經(jīng)深入地滲透到了生命科學(xué)/醫(yī)學(xué)的研究與實(shí)驗(yàn)中,。尤其是如生物醫(yī)學(xué)工程,、仿生學(xué)等一些交叉學(xué)科，新材料新方法的引入已經(jīng)極大促進(jìn)了這些領(lǐng)域從理論到實(shí)際應(yīng)用的延伸,。
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