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隨著生物組學(xué)技術(shù)的進步,，細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)已不再局限于簡單的工藝參數(shù)優(yōu)化,，而是深入探索系統(tǒng)的組學(xué)研究。這樣的轉(zhuǎn)變旨在更好地滿足生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需求,。為此,，細(xì)胞培養(yǎng)需要朝著大規(guī)模、自動化,、低成本以及高目的產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量的方向發(fā)展,。在這一發(fā)展過程中，準(zhǔn)確監(jiān)測生物過程中的實際需求至關(guān)重要,，尤其是確定最關(guān)鍵的質(zhì)量參數(shù),。

抗體藥物是通過培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞來制造的。開發(fā)這些宿主細(xì)胞是一個活躍的研究領(lǐng)域,，大阪大學(xué)的Omasa實驗室最近建立了源自中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL-YN細(xì)胞）的細(xì)胞系,。與常用于抗體生產(chǎn)的CHO-K1細(xì)胞相比，CHL-YN細(xì)胞的生長速度約為2倍,。

了解宿主細(xì)胞的代謝對于實現(xiàn)這些細(xì)胞在工業(yè)上的應(yīng)用非常重要,，但對于CHL-YN細(xì)胞的代謝尚未進行充分研究。最近的研究報告了培養(yǎng)基中有機/無機組分變化對抗體生產(chǎn)和質(zhì)量的影響,。因此,，培養(yǎng)基的分析必須包括有機和無機組分，以便能夠了解宿主細(xì)胞的代謝過程,。這將有助于優(yōu)化抗體生產(chǎn)過程,，提高抗體質(zhì)量，進而推動抗體藥物的研發(fā)與應(yīng)用,。

本應(yīng)用報告使用LCMS-8060NX分析 140多種有機化合物,，并使用 ICPMS-2030分析 CHL-YN 抗體產(chǎn)生細(xì)胞系培養(yǎng)物的培養(yǎng)基和培養(yǎng)上清液中的 9 種無機元素。通過這些數(shù)據(jù),，研究人員得以確定參與抗體生產(chǎn)的成分和代謝途徑,。

樣品：

CHL-YN細(xì)胞在指定條件下培養(yǎng)，每24小時收集培養(yǎng)上清液（生物學(xué)重復(fù)n = 3）,。

樣品前處理方法：

圖1 LC-MS/MS樣品前處理方法

圖2  ICP-MS樣品前處理方法

分析條件：略,。

分析結(jié)果：

LC-MS/MS部分：

結(jié)合LC/MS/MS細(xì)胞培養(yǎng)分析方法包檢測到74種組分的數(shù)據(jù)，再通過多組學(xué)分析包進行可視化分析,。74種有機組分隨時間變化過程如圖3所示,。

圖3  74種有機組分隨時間變化過程分析結(jié)果

其中，表現(xiàn)出明顯變化的組分如圖4和圖5所示,。圖4中顯示,，有機組分在細(xì)胞培養(yǎng)的后期耗盡,，提供了有助于研究培養(yǎng)條件的信息。圖5中顯示,，隨著時間的推移,，有機組分在消耗和分泌之間切換。這是一個有價值的發(fā)現(xiàn),，表明新陳代謝發(fā)生了變化,。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)后期耗盡的有機組分

圖5  隨著時間的推移在消耗和分泌之間切換的有機組分

面積比（縱軸）：被測組分的峰面積除以內(nèi)標(biāo)峰面積。

每個數(shù)據(jù)點代表n = 3個生物重復(fù)的平均值;陰影區(qū)域表示誤差范圍

ICP-MS部分：

使用ICPMS-2030分析培養(yǎng)基上清液中的金屬元素,，主要集中在據(jù)報道影響抗體產(chǎn)生的元素上：鈷,、銅、鐵,、鎂,、錳、鉬,、鎳,、硒和鋅。

圖6  ICP-MS測定培養(yǎng)上清液中金屬組分隨時間變化的過程

每個數(shù)據(jù)點代表n = 3個生物重復(fù)的平均值;陰影區(qū)域表示誤差范圍,。

數(shù)據(jù)分析：

利用得到的數(shù)據(jù)可以開展進一步代謝組學(xué)分析,，如相關(guān)分析和富集分析。

通過以特異性抗體產(chǎn)生速率（單位時間內(nèi)單個細(xì)胞產(chǎn)生的抗體量）為目標(biāo)變量,，以有機和無機組分的測定值為解釋變量進行相關(guān)性分析,，確定抗體產(chǎn)生中涉及的組分和代謝途徑。

絕對相關(guān)系數(shù)大于0.5且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）小于0.05的組分被確定為與特異性抗體產(chǎn)生率相關(guān),。

通過相關(guān)分析確定了符合這些標(biāo)準(zhǔn)的有機和無機組分,。上表顯示了與特異性抗體產(chǎn)生率呈正相關(guān)的一些組分（相關(guān)系數(shù)>0.5和FDR<0.05）。

總結(jié)：

1.通過簡單的樣品前處理,，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)上清液中的有機組分和無機組分進行同時分析,，并提供每種組分隨時間變化的數(shù)據(jù)。

2.發(fā)現(xiàn)了耗盡或表明代謝轉(zhuǎn)變的組分,。

3.以特異性抗體產(chǎn)生速率為目標(biāo)變量進行的相關(guān)分析確定了與抗體產(chǎn)生相關(guān)的成分以及與抗體產(chǎn)生相關(guān)的代謝途徑,。

4.使用島津LC-MS/MS和ICP-MS分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的組分獲得的數(shù)據(jù)，可以鑒定抗體生產(chǎn)中涉及的化合物和代謝途徑,。

[致謝]

本應(yīng)用報告是島津與大阪大學(xué)研究生院Omasa實驗室聯(lián)合研究計劃的一部分,。感謝參與這項研究計劃的每一位研究者的幫助。

參考文獻：

1,，an-01-00498, Shimadzu Application News, Culture Medium Analysis for a Metabolic Analysis of Antibody-Producing Cells Using LC-MS/MS and ICP-MS

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