導(dǎo)讀

抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用挽救了無數(shù)人的生命,，被稱為“20世紀(jì)最偉大的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)"。然而,，臨床抗生素的濫用,，使多重耐藥菌成為抗感染治療的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。人體毒性低,、抗多重耐藥菌的新型抗生素的研制與開發(fā),，一直是臨床上的重要課題。在抗生素的開發(fā)和生產(chǎn)中,，抗生素結(jié)構(gòu)的確認至關(guān)重要,。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，抗生素可以分為大環(huán)內(nèi)酯類,、β-內(nèi)酰胺類,、氨基糖苷類、多肽類等抗生素,，其中多肽類抗生素符合多肽的結(jié)構(gòu)特征,，可以使用蛋白質(zhì)測序儀進行氨基酸殘基順序的確認。常見的多肽類抗生素有多粘菌素類（多粘菌素B,、多粘菌素E）,、桿菌肽類和萬古霉素等，其中多黏菌素和萬古霉素被認為是對抗某些多重耐藥菌的最后一道防線,。今天,，我們以多粘菌素B為例，一起來看看蛋白質(zhì)測序儀PPSQ如何測定多肽類抗生素的氨基酸序列,。

快速了解多粘菌素B

多黏菌素B( Polymyxin B,，PMB）于1947 年在多黏類芽孢桿菌( Bacillus polymyxa) 中發(fā)現(xiàn)，是一種五價陽離子型（含5個α, γ--二氨基丁酸）十肽抗生素,，由N-端脂肪?；湣⒕€性三肽,、環(huán)狀七肽構(gòu)成,，對革蘭氏陰性桿菌有強效殺菌作用，但由于具有較高的腎毒性,，只能局部( 耳,、眼) 用藥。PMB為發(fā)酵的混合型多肽類抗生素,，組分種類較多,，目前已發(fā)現(xiàn)的組分超過30種，其中占比較高的四種主要組分包括B1,、Ile-B1,、B2,、B3,。這四種組分組成氨基酸包括亮氨酸,、異亮氨酸、苯丙氨酸,、蘇氨酸,、二氨基丁酸，結(jié)構(gòu)通式及信息表見下,。

圖1 多黏菌素B的結(jié)構(gòu)通式

表1 多黏菌素B組分信息表

島津解決方案

目前對多黏菌素B結(jié)構(gòu)的研究主要為氨基酸組成成分,、氨基酸構(gòu)型分析等，氨基酸序列的研究報道較少,。氨基酸序列是其能否正確發(fā)揮生物活性的重要基礎(chǔ),，島津與上海藥檢所合作開發(fā)了應(yīng)用蛋白質(zhì)測序儀對多粘菌素B進行氨基酸序列分析的方法[1]。蛋白質(zhì)測序儀執(zhí)行全自動化的Edman降解反應(yīng),，從N端開始測定每個位點的氨基酸種類,。本研究以B2組分為例，對其進行分離純化和酶解后,，獲得去除N-?；炬溂?位二氨基丁酸的肽鏈，解除了N端封閉,，通過蛋白質(zhì)測序儀PPSQ-53A測定其氨基酸順序,。

l 儀器配置及序列分析原理

Edman降解法是進行N端氨基酸序列分析的經(jīng)典方法，島津以其為原理設(shè)計的全自動蛋白質(zhì)測序儀（以下簡稱PPSQ）,，由液相系統(tǒng)和可執(zhí)行自動化Edman降解反應(yīng)的主機組成,，將氨基酸從多肽鏈的N端依次切割下來，通過色譜的保留時間判定氨基酸種類,，結(jié)果直接可靠,。PPSQ除了測定標(biāo)準(zhǔn)氨基酸外，還可以測定非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸,。多粘菌素B中含有非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸α, γ--二氨基丁酸（DABA）,，可通過標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間的測定與其他標(biāo)準(zhǔn)氨基酸一起進行氨基酸種類的鑒別。

島津蛋白質(zhì)測序儀PPSQ-53A

Edman降解反應(yīng)圖解

l 樣品前處理

使用液相系統(tǒng)純化制備多黏菌素B2組分（PMB2）,，加入無花果蛋白酶對其進行酶解,，解除N端封閉。PMB2酶解后的結(jié)構(gòu)式見下圖,。通過液相系統(tǒng)對酶解產(chǎn)物進行分離純化,，獲得去除N-酰基脂肪鏈及隨后1位二氨基丁酸的肽鏈,，使用PPSQ-53A測試樣品N端前9個氨基酸的序列,。

多黏菌素B2的酶解產(chǎn)物

l 經(jīng)酶解處理的多黏菌素B2氨基酸序列分析色譜圖

應(yīng)用蛋白質(zhì)測序儀PPSQ-53A分析經(jīng)酶解處理的多黏菌素B2組分的氨基酸序列,，色譜圖顯示，樣品氨基酸序列為Thr-DABA-X-DABA-Phe-Leu-DABA-DABA-Thr（X代表無信號檢出）,，與理論順序一致,。第三位氨基酸在原構(gòu)型中與相鄰氨基酸為環(huán)狀連接，當(dāng)Edman反應(yīng)發(fā)生時,，一端被切開,，另一端仍與相鄰氨基酸相連，因此在檢測中理論無氨基酸信號產(chǎn)生,。

PMB2酶解產(chǎn)物的氨基酸序列分析色譜

結(jié)語

蛋白質(zhì)及多肽的N端氨基酸序列分析,，一直以來是生物藥領(lǐng)域蛋白及多肽類藥物質(zhì)量控制的經(jīng)典方法，也是未知活性多肽及蛋白質(zhì)鑒定的重要依據(jù),。島津蛋白質(zhì)測序儀,，自1988年第一代產(chǎn)品發(fā)布以來，持續(xù)三十多年來服務(wù)于生命科學(xué)研究,、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣大用戶,，本研究中對多肽類抗生素多粘菌素B氨基酸序列的分析，讓我們期待蛋白質(zhì)測序儀將來可以為更多新型多肽類抗生素及其他活性抗菌肽的開發(fā)發(fā)揮價值,。

參考文獻（上海藥檢所和島津聯(lián)合發(fā)表）：

[1] Zhang H , Li F , Dun J , et al. Combination of Derivatization–HPLC–MS and Enzymatic Hydrolysis–Edman Degradation for Amino Acid Sequence and Configuration of Polymyxin B Components[J]. Chromatographia, 2021, 84(11):1057-1064                     

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