導(dǎo)讀

2021年12月3日,，國家醫(yī)療保障局召開新聞發(fā)布會(huì)公布2021年國家醫(yī)保藥品目錄調(diào)整結(jié)果,，于2022年1月1日正式執(zhí)行。治療罕見病脊髓性肌萎縮癥（SMA）的藥物諾西那生鈉注射液被納入醫(yī)保,，價(jià)格從曾經(jīng)的70萬一針降至3.3萬,，為患者及其家庭帶來福音。SMA是一種罕見的遺傳性神經(jīng)肌肉疾病,，是由于SMN1基因突變或缺失,，造成與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元密切相關(guān)的SMN蛋白缺乏，導(dǎo)致肌肉萎縮,，大部分患者因?yàn)楹粑ソ叨劳?。諾西那生鈉的有效成分是一種反義寡核苷酸，可以改變SMN2前mRNA的剪接,，增加完整長度SMN蛋白的產(chǎn)生，達(dá)到治病的目的,。 

什么是寡核苷酸藥物,？

寡核苷酸藥物通常指由人工合成的長度50個(gè)以內(nèi)核苷酸組成的一類藥物，包含單鏈或雙鏈DNA或RNA,。目前研究較多的是反義寡核苷酸藥物（ASO）和小干擾RNA藥物(siRNA),。與小分子藥物和單抗藥物靶向蛋白質(zhì)不同，寡核苷酸藥物通常靶向mRNA,，從轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行治療,，具有特異性好,、有效性高和長效性突出的優(yōu)勢。

寡核苷酸藥物分析和表征

為了保證產(chǎn)品的安全性和有效性,，寡核苷酸藥物通常需要從分子量,、堿基序列、解鏈溫度Tm,、產(chǎn)品純度,、有關(guān)物質(zhì)等方面進(jìn)行分析，需要使用質(zhì)譜,、生物惰性液相色譜,、紫外分光光度計(jì)等儀器，島津公司開發(fā)了一系列的解決方案,，供您參考,。

分子量表征

寡核苷酸藥物通常使用固相亞磷酰胺化學(xué)法進(jìn)行合成，亞磷酰胺單體是合成的關(guān)鍵原料,。寡核苷酸藥物的分子量則是其重要的產(chǎn)品屬性,。因此，檢測寡核苷酸藥物及其合成用原料亞磷酰胺單體的分子量是常用的質(zhì)量控制手段,。常用的分子量檢測方法是質(zhì)譜法,。島津質(zhì)譜產(chǎn)品四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LCMS-9030）、單四極桿質(zhì)譜儀（LCMS-2050）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-8030）都是寡核苷酸藥物及其原料分子量表征的常用儀器,。下面就為大家?guī)鞶TOF LCMS-9030測定寡核苷酸藥物精確分子量和MALDI-8030測定亞磷酰胺單體分子量的精彩案例,。

l LCMS-9030分析寡核苷酸藥物分子量

島津四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜 LCMS-9030具有高分辨率、高質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度和媲美三重四極桿靈敏度的特點(diǎn),，可以準(zhǔn)確測定寡核苷酸分子量,。寡核苷酸分子帶負(fù)電，通常使用ESI負(fù)離子模式檢測,，在質(zhì)譜圖上常觀測到一系列的多電荷離子,，需要進(jìn)行解卷積處理，得到寡核苷酸分子量,。

LCMS-9030結(jié)合Insight Explore CSD分析結(jié)果

寡核苷酸藥物序列: 5'-mG-mC*-mC*-mU*-mC*-dA-dG-dT-dC*-dT-dG-dC*-dT-dT-dC*-mG-mC*-mA-mC*-mC*-3'

理論單同位素分子量：6431.7239

采用QTOF LCMS-9030采集一個(gè)長度為20 mer的寡核苷酸藥物的高分辨質(zhì)譜圖,，使用Insight Explore CSD進(jìn)行解卷積處理，得到實(shí)測單同位素分子量為6431.7236,，質(zhì)量數(shù)偏差為0.05 ppm,。

l MALDI-8030分析亞磷酰胺單體的分子量

采用MALDI-8030測定了四種亞磷酰胺單體的分子量，在線性正離子模式下,，均檢測到顯著質(zhì)譜峰,，質(zhì)荷比大小與鉀離子加合峰相符。MALDI-8030體積緊湊,、分析速度快,、維護(hù)方便,，是寡核苷酸樣品分析的有力工具。

序列確認(rèn)

寡核苷酸的序列同設(shè)計(jì)序列一致,，是保證藥物有效性的重要方面,。采用MALDI-8030測定了長度為20 mer的一種寡核苷酸的分子量和堿基序列。寡核苷酸的MADLI-TOF質(zhì)譜圖主要以單電荷和雙電荷形式存在,，可直接讀出分子量,，操作簡單，結(jié)果直觀,。利用源內(nèi)裂解技術(shù)（ISD）,，寡核苷酸更傾向于形成w型碎裂離子,，碎裂離子譜圖更簡單。通過比對這些碎片離子信息，可以較容易地讀出核酸序列,。

寡核苷酸MALDI-ISD-TOF質(zhì)譜圖和碎裂離子

解鏈溫度（Tm）

隨著溫度升高,，雙鏈核酸分子的雙鏈結(jié)構(gòu)開始打開,，最終變成兩條單鏈的結(jié)構(gòu),。Tm是雙鏈核酸分子雙鏈結(jié)構(gòu)解開一半時(shí)的溫度，是雙鏈核酸分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要指標(biāo),。使用島津UV Tm分析系統(tǒng)可以非常方便地測定雙鏈核酸分子的Tm,。該系統(tǒng)由紫外分光光度計(jì)、電熱溫度控制單元和Tm分析軟件組成,。Tm分析軟件可以控制溫度控制單元準(zhǔn)確控溫,，升溫速率12檔可調(diào)，可滿足雙鏈核酸分子解鏈曲線的連續(xù)測定,。Tm分析軟件還可以自動(dòng)分析解鏈曲線,，給出準(zhǔn)確的Tm數(shù)值。

UV Tm分析系統(tǒng)組成（左）和核酸樣品Tm分析結(jié)果（右）

純度分析

使用生物惰性液相Nexera XS Inert結(jié)合Shim-pack Scepter C18色譜柱進(jìn)行了寡核苷酸樣品的快速純度分析,，寡核苷酸和其雜質(zhì)分離良好,。即使在50℃高溫、0.1M TEAA的鹽濃度條件下分析,，也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,。基于有機(jī)雜化顆粒硅膠技術(shù)的Shim-pack Scepter C18,，適合用于寡核苷酸純度以及雜質(zhì)分析,。

12 mer寡核苷酸樣品純度分析UHPLC色譜圖

遞送介質(zhì)分析

遞送介質(zhì)是將核酸藥物遞送至靶組織，穿透細(xì)胞膜,，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮藥效的關(guān)鍵。脂質(zhì)納米粒（LNP）和聚乙烯亞胺（PEI）都是核酸藥物的常用遞送介質(zhì),。LNP通常包含陽離子脂質(zhì),、膽固醇,、PEG修飾脂質(zhì)和輔助性中性脂質(zhì)，四種成分協(xié)同作用,，將寡核苷酸包裹并遞送到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用,。PEI是一種水溶性高分子聚合物，攜帶大量正電荷,，可通過靜電作用結(jié)合核酸藥物,，將其遞送至細(xì)胞內(nèi)，并保護(hù)其免受核酸酶降解,。遞送介質(zhì)的含量檢測對寡核苷酸藥物給藥方式,、藥學(xué)研究等具有重要意義。

利用島津生物惰性液相系統(tǒng)結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器ELSD-LT III建立了定量分析LNP中四種成分含量,，以及PEI含量的分析方法,。

結(jié)語

天價(jià)寡核苷酸藥物首進(jìn)醫(yī)保，使得這類藥物在近期迅速刷屏,，備受關(guān)注,。對寡核苷酸藥物進(jìn)行分析和表征，可以更好地保證產(chǎn)品的藥效和安全性,?；趰u津豐富的分析儀器產(chǎn)品線，我們利用QTOF LCMS-9030,、單四極桿質(zhì)譜LCMS-2050,、MALDI TOF質(zhì)譜、UHPLC,、UV Tm分析系統(tǒng)等技術(shù)平臺(tái),，開發(fā)了分子量表征、核苷酸序列確認(rèn),、Tm測定,、純度分析和遞送介質(zhì)分析的方法，助力寡核苷酸藥物研發(fā)和質(zhì)控,，希望未來開發(fā)出更多更好的藥物,，造福患者,。

本文內(nèi)容非商業(yè)廣告,，僅供專業(yè)人士參考。