由Equine Racing Co.，Ltd.的*執(zhí)行官M(fèi)asaru Sese先生提供

1.簡(jiǎn)介

在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,，除尿液作為藥物測(cè)試樣品外,，毛發(fā)樣品也在不斷引起研究者注意。由于通常藥物作為尿代謝產(chǎn)物接收檢測(cè)時(shí),，如果沒(méi)能在藥物清除前采集到尿液樣品,，就無(wú)法檢測(cè)出來(lái),。而毛發(fā)中的藥物則不會(huì)代謝掉,，并且停留時(shí)間很長(zhǎng)。換言之,，尿液中的藥物可能會(huì)在后一次攝入后幾天內(nèi),，由于代謝和排泄的關(guān)系排除體外，而毛發(fā)樣品的特點(diǎn)在于只要不修剪,，即可長(zhǎng)期保留攝入歷史,。

目前，已將氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜質(zhì)譜（LC-MS）等常規(guī)手段作為檢測(cè)毛發(fā)樣品的新方法,，投入實(shí)際使用,。采集的毛發(fā)經(jīng)洗滌、干燥后,，切割為約5mm至1cm長(zhǎng)度,，經(jīng)提取,、純化后，進(jìn)行分析,。人類毛發(fā)平均每月增長(zhǎng)1cm,，如果可以確定所測(cè)毛發(fā)的位置，即可確定“何時(shí)使用過(guò)藥物”,、“使用過(guò)何種藥物”以及“用量多少”,。請(qǐng)關(guān)注Ono、Mizuno 等人的文獻(xiàn),，該文獻(xiàn)作為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的毛發(fā)分析提供參考,，包括上述樣品預(yù)處理方法(1) - (3)。

當(dāng)前此類毛發(fā)分析方法不僅在人來(lái)源樣品,，同時(shí)在賽馬藥物檢測(cè)領(lǐng)域引起了關(guān)注(4)(5),。迄今報(bào)告用于馬毛分析的測(cè)試樣品均來(lái)自馬鬃毛（以下簡(jiǎn)稱“馬毛”）。但是,，馬毛通常較長(zhǎng),，需要充分洗滌和干燥來(lái)去除樣品表面的污染物。另外,，由于切割后所得樣品數(shù)量很多,，前處理過(guò)程也會(huì)十分麻煩。

鑒于此,，目前除GC-MS或LC-MS方法以外,，已有報(bào)道使用質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)進(jìn)行毛發(fā)分析的新方法。利用MSI,，經(jīng)預(yù)處理的毛發(fā)樣品可被直接分析,。近年來(lái)，Kamata等發(fā)表使用MSI檢測(cè)人類毛發(fā)中藥物攝入史的開(kāi)創(chuàng)性論文(6) (7),。使用MSI檢測(cè)毛發(fā)中的藥物攝入史,，則必須沿縱向去除毛發(fā)角質(zhì)層，露出髓質(zhì),。該過(guò)程十分困難,，因此如參考文獻(xiàn)6所述，盡管制造用裝置進(jìn)行該步驟,，依然無(wú)法去除長(zhǎng)度超過(guò)約1-2cm的角質(zhì)層,。與人的毛發(fā)不同，馬的鬃毛很長(zhǎng),，從而導(dǎo)致這一過(guò)程變得更加麻煩,，因此目前尚未有在馬毛中進(jìn)行檢測(cè)藥物攝入的報(bào)道。本文將介紹使用MSI技術(shù)檢測(cè)馬毛中甾體抗炎藥磷酸地塞米松的應(yīng)用實(shí)例,，該馬毛樣品長(zhǎng)4cm,，經(jīng)手動(dòng)方式去除角質(zhì)層,。

2.質(zhì)譜成像

在質(zhì)譜分析時(shí)，分子被離子化,，根據(jù)其在電場(chǎng)和磁場(chǎng)中的位移差來(lái)測(cè)量其質(zhì)量（實(shí)際為m/z值,，將質(zhì)量除以離子所帶電荷數(shù)）。如前所述,，MSI與使用現(xiàn)有GC-MS和LC-MS方法的不同之處在于,，無(wú)需進(jìn)行提取，可直接分析樣品表面,，獲得待測(cè)藥物空間分布信息,。

通常的實(shí)驗(yàn)步驟包括準(zhǔn)備樣品切片，并將其放置在ITO導(dǎo)電玻璃上,。隨后樣品被電離并進(jìn)行質(zhì)譜分析,。在分析時(shí)，確定樣品檢測(cè)區(qū)域和測(cè)量點(diǎn)間的間隔,，獲取每個(gè)測(cè)量點(diǎn)的質(zhì)譜圖及對(duì)應(yīng)位置信息,。獲取所有測(cè)量點(diǎn)質(zhì)譜圖后，選擇與目標(biāo)分子對(duì)應(yīng)的m/z,，并根據(jù)其強(qiáng)度分布獲得目標(biāo)分子的定位信息,。與常規(guī)成像技術(shù)不同，IMS不需要進(jìn)行免疫化學(xué)染色或GFP標(biāo)記等,。由于直接獲得分子量信息,，可區(qū)分目標(biāo)化合物的原型及其代謝物；由于能夠同時(shí)電離多種化合物并進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),，可在一次分析中獲得多種不同物質(zhì)的定位信息,。

3.iMScope TRIO的開(kāi)發(fā)理念

目前，可以在多種質(zhì)譜儀上進(jìn)行MSI實(shí)驗(yàn),，可選擇的離子源以及質(zhì)譜種類也是各種各樣,。自2004年以來(lái)，作者與島津株式會(huì)社(8)合作開(kāi)發(fā)iMScope TRIO™成像質(zhì)譜顯微鏡,，目前正在大阪大學(xué)島津分析創(chuàng)新研究實(shí)驗(yàn)室(9)進(jìn)行各種相關(guān)應(yīng)用研究,。

iMScope TRIO的開(kāi)發(fā)理念如圖1所示。盡管普通顯微鏡可以觀察組織結(jié)構(gòu),，但很難獲取相關(guān)各種組分的信息。另一方面,，iMScope TRIO將對(duì)樣品的顯微觀察和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)相結(jié)合從而進(jìn)行成像質(zhì)譜分析,。

圖1 iMScope TRIO™成像質(zhì)譜顯微鏡的理念

使用常規(guī)顯微鏡，可區(qū)分樣品結(jié)構(gòu)上的差異,，但是難以獲取相關(guān)化學(xué)成分的信息,。相比之下,，iMScope TRIO™可同時(shí)進(jìn)行光學(xué)顯微觀察和質(zhì)譜檢測(cè)，獲得對(duì)應(yīng)組分的強(qiáng)度分析信息,。

4.實(shí)驗(yàn)方法

圖2 本研究中使用的分析設(shè)備

（A）iMLayer™：基質(zhì)升華儀,，（B）iMScope TRIO ™：成像質(zhì)譜檢測(cè)，以及（C）iMScope TRIO ™系統(tǒng)的示意圖,。該系統(tǒng)在大氣壓下進(jìn)行樣品的顯微鏡觀察,，并使用MALDI電離方式，生成的離子引入離子阱并由飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè),。

本研究使用iMLayer™基質(zhì)升華儀進(jìn)行MALDI基質(zhì)涂敷（圖2（A））,。所用基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，Merck）和9-氨基吖啶（9-AA,，東京化學(xué)工業(yè)有限公司）,，分別用于正離子模式分析和負(fù)離子模式分析，通過(guò)iMLayer在樣品表面上涂敷厚度為0.5 μm的基質(zhì),。正離子模式分析中,，基質(zhì)升華后，使用噴槍手動(dòng)噴涂α-CHCA溶液（10   mg/ml,，使用30％乙腈/0.1%甲酸溶液）(10),。負(fù)離子模式分析中，9-AA升華后,，將5％的甲醇蒸氣噴覆于樣品表面3秒鐘,，進(jìn)行重結(jié)晶(11)。

使用iMScope TRIO進(jìn)行檢測(cè)（圖2（B）,，（C））,。如上所述，iMScope TRIO配有光學(xué)顯微鏡,，可在大氣壓下獲得樣品表面圖像,，同時(shí)配置大氣壓MALDI離子源。MALDI所用激光器為Nd:YAG激光器,，頻率為1 kHz,。在大氣壓下產(chǎn)生的離子通過(guò)差級(jí)真空系統(tǒng)導(dǎo)入質(zhì)量分析單元，并由離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè),。質(zhì)量范圍（m/z）在   50-3000之間,，本次目標(biāo)藥物磷酸地塞米松為小分子藥物，質(zhì)量范圍設(shè)定至m/z 1000,。

圖3（A）分析流程和（B）馬毛表皮去除方法

在立體顯微鏡下使用冷凍切片機(jī)刀片去除角質(zhì)層,，暴露出髓質(zhì)

圖3（A）顯示該樣品的的分析流程。基本過(guò)程：采集馬毛,、去除角質(zhì)層,、涂覆基質(zhì)、使用iMScope TRIO檢測(cè)成像,。用浸有蒸餾水的布擦拭所采集每一束馬毛的表面,。該方式僅針對(duì)MSI可行，因?yàn)镸SI無(wú)需提取即可直觀分析樣品,。相反,，在已有方法中，如清洗不充分,，在提取過(guò)程中會(huì)發(fā)生污染問(wèn)題,。清潔馬毛表面后，立即干燥馬毛,。將干燥后的馬毛固定于黏貼導(dǎo)電雙面膠帶的ITO載玻片（Matsunami Glass Ind.,，Ltd.）上，并使用切片刀在立體顯微鏡下從毛囊末端開(kāi)始去除角質(zhì)層,，如圖3（B）所示,。由于馬毛的直徑約為人類毛發(fā)直徑的兩倍（約200μm），因此即使通過(guò)手動(dòng)操作,，也可輕松去除表面,。除去角質(zhì)層后，將剩余附著于ITO玻璃載玻片上的毛發(fā)作為待測(cè)樣品,，涂覆基質(zhì)并進(jìn)行檢測(cè),。

本研究所使用藥物為地塞米松磷酸鈉（DexaSP），為一類甾體類抗炎藥,。DexaSP可使用9-AA基質(zhì)直接以負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè),。或者,，通過(guò)用吉拉德T試劑（GirT）對(duì)DexaSP進(jìn)行衍生化,，提高正離子模式的離子化效率（圖4）⁽¹²⁾。

圖4 地塞米松磷酸鈉（DexaSP）是靶向藥物

如進(jìn)行正離子模式檢測(cè),，將以Gir T試劑作為衍生試劑生成的DexaSP衍生物作為檢測(cè)目標(biāo),。

對(duì)于負(fù)離子模式檢測(cè)，將無(wú)變化的DexaSP作為檢測(cè)目標(biāo),。

5.結(jié)果

圖5顯示使用標(biāo)準(zhǔn)品在正離子模式和負(fù)離子模式獲得的檢測(cè)結(jié)果,。

圖5標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果

正離子模式和負(fù)離子模式均可獲得信號(hào)，但考慮前處理的簡(jiǎn)便性和離子強(qiáng)度的差異,，選擇負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè),。

如前所述,，在正離子模式檢測(cè)中,，將GirT衍生后的DexaSP衍生物作為檢測(cè)目標(biāo),，而在負(fù)離子模式檢測(cè)中，將無(wú)變化DexaSP作為檢測(cè)目標(biāo),。正離子模式下,， 使用α-CHCA   檢測(cè)，DexaSP衍生物的質(zhì)荷比為m/z   586.267,，對(duì)應(yīng)[GirT-DexaSP-2Na + 2H] +離子,。另一方面，負(fù)離子模式中,，使用9-AA檢測(cè),， [DexaSP-H]- 的質(zhì)荷比為m/z 471.160。

兩種模式下均觀察到DexaSP由來(lái)的峰,，但鑒于前處理所需時(shí)間且負(fù)離子模式強(qiáng)度約高出正離子模式100倍,，決定使用9-AA在負(fù)離子模式下對(duì)馬毛進(jìn)行檢測(cè)。

分析可疑馬毛樣本時(shí),，需進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),，檢測(cè)未給予DexaSP的馬毛樣品，確認(rèn)沒(méi)有m/z 471.160離子的出現(xiàn)（圖6（A））,。圖6（B）顯示地塞米松磷酸酯給藥后馬毛的質(zhì)譜成像結(jié)果,。

圖6馬毛中DexaSP分布檢測(cè)結(jié)果

（A）是未給藥馬匹的馬毛檢測(cè)結(jié)果，作為陰性對(duì)照,；（B）給藥后馬匹的馬毛中檢測(cè)結(jié)果（注射15-20 mL由Fujita Pharmaceutical Co.提供的0.1％地塞米松磷酸鈉水溶液,，濃度1.315 mg/mL， 連續(xù)注射3天）,。用iMScope TRIO™掃描從毛囊開(kāi)始4 cm長(zhǎng)度的馬毛樣本,，記錄每1 cm馬毛的檢測(cè)結(jié)果，在距毛囊16.48 mm處觀察到較強(qiáng)的目標(biāo)藥物信號(hào),。由于馬毛平均每月以2.0 cm的速度生長(zhǎng),，可判斷在采樣日期前25天給藥。

測(cè)試樣品為2017年7月13日采集的馬毛,，該馬匹在2017年6月上旬,，連續(xù)3天注射15至20 mL 0.1％的地塞米松磷酸鈉水溶液（Fujita Pharmaceutical Co）。iMScope TRIO的測(cè)量間隔在x方向上為80 μm,，在y方向上為5 μm,，激光斑點(diǎn)大小為2（系統(tǒng)參數(shù)）。

在該實(shí)驗(yàn)中,，測(cè)量總長(zhǎng)為4cm的馬毛,，將其劃分為1cm的區(qū)間分別進(jìn)行檢測(cè),。在圖6（B）中，所得數(shù)據(jù)雖然分為4個(gè)部分,，但馬毛樣本并未被分割：4cm長(zhǎng)的馬毛被固定在ITO載玻片上,。

從毛囊向*進(jìn)行掃描，并在距毛囊約16.48 mm處,，檢測(cè)到較高強(qiáng)度地塞米松磷酸酯信號(hào),。該結(jié)果是*從毛發(fā)中直接檢測(cè)到原本會(huì)于體內(nèi)迅速代謝的磷酸酯，具有重要意義,。此處質(zhì)譜成像結(jié)果使用強(qiáng)度來(lái)表示峰強(qiáng)度,，并在300-1500強(qiáng)度范圍內(nèi)以多色帶顯示。在這一結(jié)果中暖色表示較高的峰強(qiáng)度,。

6.討論

本實(shí)驗(yàn)中,，根據(jù)目標(biāo)化合物離子化效果選擇負(fù)離子模式進(jìn)行分析，成功在馬毛中檢測(cè)出目標(biāo)藥物,。給藥后的馬毛樣本中,，在距毛囊16.48 mm位置處觀察到較強(qiáng)的藥物信號(hào)。馬毛的平均生長(zhǎng)速度為每月2cm,，是人類的兩倍,。基于該生長(zhǎng)速率以及大強(qiáng)度信號(hào)距離毛囊的位置估算給藥時(shí)間,，大約在24-25天前,。根據(jù)給藥記錄，該藥物在采集毛發(fā)前約一個(gè)月給藥,，通過(guò)對(duì)比該信息,，認(rèn)為藥物定位正確。

另一方面,，盡管離子強(qiáng)度較低,，但是在毛囊附近依然檢測(cè)到一些信號(hào)。經(jīng)確認(rèn)質(zhì)譜圖,，發(fā)現(xiàn)該信號(hào)源自噪聲,，由此認(rèn)為進(jìn)一步提高離子化效率和信噪比對(duì)分析實(shí)際樣品十分重要。為達(dá)到這一目標(biāo),，可能需要進(jìn)一步改進(jìn)基質(zhì)涂覆方法或選擇其他基質(zhì),。

7.總結(jié)與展望

地塞米松磷酸鈉是一種經(jīng)獲準(zhǔn)使用的抗炎藥，但禁止在比賽前使用(13),。近一次在2016年12月東京大獎(jiǎng)賽上,，賽馬阿波羅肯塔基在賽后發(fā)現(xiàn)使用過(guò)這一藥物的事件依然記憶猶新。本次結(jié)果是將iMLayer基質(zhì)升華與iMScope TRIO成像質(zhì)譜分析相結(jié)合,，應(yīng)用于違禁藥物檢測(cè)領(lǐng)域的示例,。

此外,，由于磷酸酯可在體內(nèi)迅速代謝，直接在毛發(fā)中檢測(cè)到未變化藥物同樣是一項(xiàng)十分重要的成果,。另一方面,，由于在成像結(jié)果中存在大量噪聲，有必要對(duì)毛發(fā)預(yù)處理流程進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,，提高離子強(qiáng)度,。從該檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,，探索對(duì)可檢測(cè)藥物（包括合成類固醇類）定量分析方法的建立也是*的,。盡管該應(yīng)用仍存在許多問(wèn)題以待解決，但我們依然認(rèn)為iMScope TRIO的潛力十分值得期待,。

8.馬毛分析的可能性

當(dāng)前,，世界范圍內(nèi)關(guān)于賽馬違禁藥物控制的討論很多，討論賽馬違禁藥物檢測(cè)和賽馬傷害保護(hù)（ICRAV：賽馬分析專家和獸醫(yī)會(huì)議）的會(huì)議每?jī)赡暾匍_(kāi)一次,。2018年,，在阿拉伯聯(lián)合酋長(zhǎng)國(guó)的迪拜舉行該會(huì)議，作者*參加并介紹了這項(xiàng)研究結(jié)果,。圖7顯示了會(huì)場(chǎng)和Meydan賽馬場(chǎng)的景色,。能夠在世界賽馬場(chǎng)之一的Meydan賽馬場(chǎng)旁會(huì)議廳中展示這項(xiàng)研究，是迄今為止作者一生中難忘的事件之一,。

通常,，來(lái)自日本的參會(huì)者均為JRA相關(guān)人員或賽馬化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究人員，而作者則是大學(xué)中的參會(huì)者,。不僅如此,，來(lái)自香港賽馬會(huì)、澳大利亞賽馬會(huì)和其他地方的研究人員對(duì)使用IMS進(jìn)行藥物檢測(cè)產(chǎn)生了濃厚興趣并寄予厚望,，討論非?；钴S。

2018年11月,，在撰寫(xiě)本文時(shí),，巖手賽馬比賽中參賽的賽馬Ubatouban被檢測(cè)出使用禁用藥品去氫睪酮(14)。今后,，作者將繼續(xù)改進(jìn)和優(yōu)化該檢測(cè)方法（包括簡(jiǎn)化毛發(fā)前處理技術(shù)）,，使這種來(lái)自日本的新型檢測(cè)方法在世界賽馬領(lǐng)域中用以進(jìn)行違禁藥品檢測(cè)。

作者同時(shí)還得到島津制作所的大力支持,，并與Equine   Racing Co., Ltd.的全體員工進(jìn)行廣泛合作,，其中來(lái)自Equine   Racing Co., Ltd.的代表人也是本文的合著者。

作者將在圖8中展示馬毛采樣圖片以及作者和合著者的新照片作為本文的結(jié)尾,。

圖7 ICRAV2018

（A）,、（B）ICRAV 2018會(huì)場(chǎng)的場(chǎng)景,，（C）舉行ICRAV的Meydan賽馬場(chǎng)傾城。Meydan賽馬場(chǎng)景色壯觀,，其規(guī)模和完備程度在日本也*,。

圖8參觀Equine Racing Co., Ltd.

（A）Equine Racing Co., Ltd.的工作人員介紹馬匹。（B）在馬腿上可以看到的稱為“栗子”的部分：角質(zhì)化的退化拇指（C）鬃毛采樣 （D）作者（右）和合著者（左）的近期照片,。

參考資料

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(13)http://company.jra.jp/0000/law/law07/07.pdf

(14) http://www.iwatekeiba.or.jp/news/180915i

本文中描述的產(chǎn)品尚未獲得日本《藥品和醫(yī)療設(shè)備法》批準(zhǔn),，尚不能用作醫(yī)療設(shè)備。該設(shè)備不能用于醫(yī)學(xué)檢查,、治療或相關(guān)程序,。

iMScope TRIO和iMLayer是島津株式會(huì)社在日本和/或其他國(guó)家的商標(biāo)。

在本文中,，無(wú)論是否以商標(biāo)符號(hào)“ TM”或“®”出現(xiàn),，第三方商標(biāo)和商品名稱均指實(shí)體或其產(chǎn)品/服務(wù)。