放線菌（Actinomycetes）是一種原核生物類群,，在自然界中分布很廣,，是一類極其重要的微生物資源,，與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切,，突出的特性就是能產(chǎn)生大量的,、種類繁多的抗生素,。放線菌能形成分枝菌絲和分生孢子,，呈菌絲狀生長,，主要通過形成無性孢子的方式進行繁殖,，也可借菌體分裂片段繁殖。放線菌長到一定階段,，一部分氣生菌絲形成孢子絲,，孢子絲成熟便分化形成許多孢子，稱為分生孢子,。
圖1 放線菌模式圖
圖2 放線菌的氣生菌絲和孢子絲
由于孢子因其體積小,、質(zhì)輕、易飄散等特點,，極易造成同一固體平板上的不同單克隆菌落間產(chǎn)生交叉污染問題,，給放線菌的培養(yǎng)和分離帶來了巨大挑戰(zhàn)。
天木生物的高通量微升級液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)——MISS cell,，可將細胞(孢子)包裹于液滴中,，形成獨立的培養(yǎng)單元，避免菌絲或孢子飛散至其它液滴單克隆內(nèi),，從而克服菌株間的交叉污染問題,，提高獲得放線菌單克隆的效率和純度。本實驗基于菌絲體實現(xiàn)放線菌的分離與培養(yǎng),，為不產(chǎn)孢子的絲狀菌的分離培養(yǎng)提供一種分離培養(yǎng)方法,。
二、使用MISS cell分離培養(yǎng)放線菌
1.樣品預(yù)處理,，確定上機濃度
收集放線菌菌絲體（30℃,，培養(yǎng)4天），加入玻璃株打碎菌絲過濾,，通過血球計數(shù)板計數(shù),，用BM培養(yǎng)基將樣品濃度稀釋至500-1000 CFU/mL，工作流程如下：
圖3 樣本處理工作流程
2.MISS cell分離培養(yǎng)
本實驗共生成2500個液滴,，培養(yǎng)96h后進行檢測及分選,，經(jīng)過60分鐘的分選,，共得到含菌液滴約500個，MISS cell儀器工作流程如下圖所示,。
圖4 MISS cell工作流程
3.實驗結(jié)果
1）生長速率對比：不同時間點觀察液滴及平板放線菌生長情況,，液滴培養(yǎng)1天后液滴中出現(xiàn)生長，平板培養(yǎng)6天后出現(xiàn)菌絲生長,，液滴培養(yǎng)放線菌生長速率顯著優(yōu)于平板培養(yǎng),，放線菌的最佳培養(yǎng)分選時間為4天。
圖5 放線菌在固體平板上的生長情況
圖6 放線菌在液滴中的生長情況
圖7 放線菌培養(yǎng)4天,，在OD模式下的分選情況
圖8 放線菌培養(yǎng)4天,，在熒光模式下的分選情況
三、天木生物MISS cell儀器為放線菌的分離,、培養(yǎng)和篩選過程提供高通量,、高效自動化解決方案
本研究中使用天木生物的MISS cell儀器，共生成2500個液滴,，分選得到單菌落約500個,，實現(xiàn)放線菌自動化培養(yǎng)和分選，有效避免了菌株之間的交叉污染,。同時,，對于不產(chǎn)孢子的絲狀菌也提供了一種分離培養(yǎng)方法。本次實驗共計消耗培養(yǎng)基8ml,，全程自動化實現(xiàn)液滴生成,、培養(yǎng)和篩選至96孔板中，大幅提升單克隆獲取效率,，同時有效避免交叉污染問題,，為放線菌的單克隆篩選提供了高效工具平臺。
天木生物MISS cell儀器為包括放線菌在內(nèi)含孢子的細菌,，提供了單克隆培養(yǎng)和高通量篩選的高效自動化實驗平臺,，為菌株的培養(yǎng)和篩選提供強力支持！
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