放線菌（Actinomycetes）是一種原核生物類(lèi)群,，在自然界中分布很廣,，是一類(lèi)極其重要的微生物資源，與人類(lèi)的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切,，突出的特性就是能產(chǎn)生大量的,、種類(lèi)繁多的抗生素。放線菌能形成分枝菌絲和分生孢子,，呈菌絲狀生長(zhǎng),，主要通過(guò)形成無(wú)性孢子的方式進(jìn)行繁殖，也可借菌體分裂片段繁殖,。放線菌長(zhǎng)到一定階段,，一部分氣生菌絲形成孢子絲，孢子絲成熟便分化形成許多孢子，稱為分生孢子,。
圖1 放線菌模式圖
圖2 放線菌的氣生菌絲和孢子絲
由于孢子因其體積小,、質(zhì)輕、易飄散等特點(diǎn),，極易造成同一固體平板上的不同單克隆菌落間產(chǎn)生交叉污染問(wèn)題，給放線菌的培養(yǎng)和分離帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn),。
天木生物的高通量微升級(jí)液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)——MISS cell,，可將細(xì)胞(孢子)包裹于液滴中，形成獨(dú)立的培養(yǎng)單元,，避免菌絲或孢子飛散至其它液滴單克隆內(nèi),，從而克服菌株間的交叉污染問(wèn)題，提高獲得放線菌單克隆的效率和純度,。本實(shí)驗(yàn)基于菌絲體實(shí)現(xiàn)放線菌的分離與培養(yǎng),，為不產(chǎn)孢子的絲狀菌的分離培養(yǎng)提供一種分離培養(yǎng)方法。
二,、使用MISS cell分離培養(yǎng)放線菌
1.樣品預(yù)處理,，確定上機(jī)濃度
收集放線菌菌絲體（30℃，培養(yǎng)4天）,，加入玻璃株打碎菌絲過(guò)濾,，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用BM培養(yǎng)基將樣品濃度稀釋至500-1000 CFU/mL,，工作流程如下：
圖3 樣本處理工作流程
2.MISS cell分離培養(yǎng)
本實(shí)驗(yàn)共生成2500個(gè)液滴,，培養(yǎng)96h后進(jìn)行檢測(cè)及分選，經(jīng)過(guò)60分鐘的分選,，共得到含菌液滴約500個(gè),，MISS cell儀器工作流程如下圖所示。
圖4 MISS cell工作流程
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1）生長(zhǎng)速率對(duì)比：不同時(shí)間點(diǎn)觀察液滴及平板放線菌生長(zhǎng)情況,，液滴培養(yǎng)1天后液滴中出現(xiàn)生長(zhǎng),，平板培養(yǎng)6天后出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)，液滴培養(yǎng)放線菌生長(zhǎng)速率顯著優(yōu)于平板培養(yǎng),，放線菌的最佳培養(yǎng)分選時(shí)間為4天,。
圖5 放線菌在固體平板上的生長(zhǎng)情況
圖6 放線菌在液滴中的生長(zhǎng)情況
圖7 放線菌培養(yǎng)4天，在OD模式下的分選情況
圖8 放線菌培養(yǎng)4天,，在熒光模式下的分選情況
三,、天木生物MISS cell儀器為放線菌的分離、培養(yǎng)和篩選過(guò)程提供高通量,、高效自動(dòng)化解決方案
本研究中使用天木生物的MISS cell儀器,，共生成2500個(gè)液滴，分選得到單菌落約500個(gè),，實(shí)現(xiàn)放線菌自動(dòng)化培養(yǎng)和分選,，有效避免了菌株之間的交叉污染,。同時(shí)，對(duì)于不產(chǎn)孢子的絲狀菌也提供了一種分離培養(yǎng)方法,。本次實(shí)驗(yàn)共計(jì)消耗培養(yǎng)基8ml,，全程自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)液滴生成、培養(yǎng)和篩選至96孔板中,，大幅提升單克隆獲取效率,，同時(shí)有效避免交叉污染問(wèn)題，為放線菌的單克隆篩選提供了高效工具平臺(tái),。
天木生物MISS cell儀器為包括放線菌在內(nèi)含孢子的細(xì)菌,，提供了單克隆培養(yǎng)和高通量篩選的高效自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，為菌株的培養(yǎng)和篩選提供強(qiáng)力支持,！
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