單抗制備常見問題分析
1. 為什么我的細(xì)胞生長很慢？
答：可能的原因：
（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材,、培養(yǎng)基,、血清、HAT或HT,。建議新手使用廠商的試劑或耗材,。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用,，選擇出比較好的批次進行實驗,。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗,，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實血清質(zhì)量,。
（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方是否正確,。
（3）制備飼養(yǎng)層的方法不正確,。參見本頁面第二個問題。
（4）其它問題,，可以參考本頁面第二個問題,。
2. 為什么融合后細(xì)胞不長或者融合后克隆很少？
答：可以從這幾個方面考慮：
（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純,。免疫用的動物一般應(yīng)該與骨髓瘤來源的動物是相同品系,，例如使用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時應(yīng)該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠,。
（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT,，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選,。
（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清,。
（4）未正確制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。參見本站有關(guān)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備的部份,。
（5）接種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板過多,。一般在5-20塊96孔板為宜。
（6）融合后,，未及時轉(zhuǎn)移或稀釋細(xì)胞,。有人在做融合后喜歡把融合的細(xì)胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，然后再滴到96孔板上,。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時間過長,，也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。
（7）細(xì)胞被污染,。在顯微鏡下仔細(xì)觀察是否有明顯的微生物污染,。即使看不到有明顯的微生物,，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測,。
（8）細(xì)胞培養(yǎng)條件不正確,，確保細(xì)胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時保證CO2濃度在4-5%左右,。
（9）其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩?。詳見本站有關(guān)細(xì)胞融合的部份。
3. 為什么我凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活,？
答：這個問題要從兩個方面來回答,，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題,。 對于凍存過程,，需要注意：
（1）凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵,，一個良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保存得非常好,，而一個不好的凍存液配方可能會讓細(xì)胞傾刻死亡。目前認(rèn)為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基,，不管是哪一種,，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低,，則起不到保護作用,，凍存的細(xì)胞終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高,，則細(xì)胞中毒而亡,。如果使用第二個配方，注意一定要用養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基,，而盡量不要用一般的*培養(yǎng)基,，而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻(xiàn)中也有提到用甘油作為凍存保護劑的,，站長自己沒有親自試過,，不發(fā)表評論。如果新手確實對這個沒把握,，上也有商品化的凍存液,，買回來按照說明書操作就OK了。
（2）凍存過程中,，不可用力過大,，在凍存液中重懸細(xì)胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下,，細(xì)胞膜變得非常脆弱,，如果用力過猛,，則細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機會就明顯會下降,。
（3）凍存的程序也非常重要,。實踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細(xì)胞是的,。如果條件簡易，可以把細(xì)胞放在4 ℃半小時左右,，然后再在-20 ℃放置1-2小時,，后轉(zhuǎn)入-80 ℃放置一晚上，終轉(zhuǎn)入液氮保存,。需要短期保存的,，直接放-80 ℃也行。現(xiàn)在上有比較貴的凍存盒,，把需要存放的細(xì)胞放進去,，然后直接放-80 ℃就行，等時間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可,。
（4）細(xì)胞需要保存在液氮的氣相中,，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管,。這一點很多人都沒有注意,，大部份人都是直接往液相里放，其實這是錯誤的,。有人認(rèn)為,，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中,，這些微生物或孢子就有機會進入凍存管,，終可能造成細(xì)胞污染。
（5）保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài),，并且沒有被污染,。
4. 為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？
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