1 圖象分析技術(shù)（Image analysis）
“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺(jué)，每一個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào),、下調(diào)及出現(xiàn),、消失,，都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生,，必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行定量分析,。 在一系列高質(zhì)量的2-DE凝膠產(chǎn)生（低背景染色,，高度的重復(fù)性）的前提下,，圖象分析包括斑點(diǎn)檢測(cè)、背景消減,、斑點(diǎn)配比和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建,。 首先，采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合CCD（charge coupled device）照相機(jī),；激光密度儀（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers,，對(duì)圖象進(jìn)行數(shù)字化。 并成為以象素（pixels）為基礎(chǔ)的空間和網(wǎng)格,。 其次,，在圖象灰度水平上過(guò)濾和變形，進(jìn)行圖象加工,，以進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè),。 利用Laplacian，Gaussian,，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意義的區(qū)域與背景分離,，限定斑點(diǎn)的強(qiáng)度、面積,、周長(zhǎng)和方向,。
圖象分析檢測(cè)的斑點(diǎn)須與肉眼觀測(cè)的斑點(diǎn)一致。 在這一原則下，多數(shù)系統(tǒng)以控制斑點(diǎn)的重心或高峰來(lái)分析,，邊緣檢測(cè)的軟件可描述斑點(diǎn)外觀,，并進(jìn)行邊緣檢測(cè)和鄰近分析，以增加度,。 通過(guò)閾值分析,、邊緣檢測(cè)、銷蝕和擴(kuò)大斑點(diǎn)檢測(cè)的基本工具還可恢復(fù)共遷移的斑點(diǎn)邊界,。 以PC機(jī)為基礎(chǔ)的軟件Phoretix-2D正挑戰(zhàn)古老的Unix為基礎(chǔ)的2-D分析軟件包,。 第三，一旦2-DE圖象上的斑點(diǎn)被檢測(cè),，許多圖象需要分析比較,、增加、消減或均值化,。 由于在2-DE中出現(xiàn)的重復(fù)性是很困難的,，由此凝膠間的蛋白質(zhì)的配比對(duì)于圖象分析系統(tǒng)是一個(gè)挑戰(zhàn)。 IPG技術(shù)的出現(xiàn)已使斑點(diǎn)配比變得容易,。 因此,，較大程度的相似性可通過(guò)斑點(diǎn)配比向量算法在長(zhǎng)度和平行度觀測(cè)。 用來(lái)配比的軟件系統(tǒng)包括Quest,，Lips,，Hermes，Gemini等,，計(jì)算機(jī)方法如相似性,、聚類分析、等級(jí)分類和主要因素分析已被采用,，而神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),、子波變換和實(shí)用分析在未來(lái)可被采用。 配比通常由一個(gè)人操作,，其手工設(shè)定大約50個(gè)突出的斑點(diǎn)作為“路標(biāo)”,，進(jìn)行交叉配比。 之后,，擴(kuò)展至整個(gè)膠,。
例如：的PI和MW（分子量）的估計(jì)通過(guò)參考圖上20個(gè)或更多的已知蛋白所組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象分析系統(tǒng)依據(jù)已知蛋白質(zhì)的pI值產(chǎn)生PI網(wǎng)絡(luò),，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配,。 所估計(jì)的度大大依賴于所建網(wǎng)格的結(jié)構(gòu)及標(biāo)本的類型。 已知的未被修飾的大蛋白應(yīng)該作為標(biāo)志,，變性的修飾的蛋白的PI估計(jì)約在±0,。25個(gè)單位,。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數(shù)據(jù)庫(kù)中計(jì)算,，利用產(chǎn)生的表觀分子量的網(wǎng)格來(lái)估計(jì)蛋白的分子量,。 未被修飾的小蛋白的錯(cuò)誤率大約30%，而翻譯后蛋白的出入更大,。 故需聯(lián)合其他的技術(shù)完成鑒定,。
2 微量測(cè)序（microsequencing）
蛋白質(zhì)的微量測(cè)序已成為蛋白質(zhì)分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息,。 盡管氨基酸組分分析和肽質(zhì)指紋譜（PMF）可鑒定由2-DE分離的蛋白，但普通的N-末端Edman降解仍然是進(jìn)行鑒定的主要技術(shù),。 目前已實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)微量測(cè)序的自動(dòng)化,。 首先使經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色,、切割,，然后直接置于測(cè)序儀中，可用于subpicomole水平的蛋白質(zhì)的鑒定,。 但有幾點(diǎn)需注意：Edman降解很緩慢,，序列以每40 min 1個(gè)氨基酸的速率產(chǎn)生；與質(zhì)譜相比,，Edman降解消耗大,；試劑昂貴，每個(gè)氨基酸花費(fèi)3～4$,。 這都說(shuō)明泛化的Edman降解蛋白質(zhì)不適合分析成百上千的蛋白質(zhì),。 然而，如果在一個(gè)凝膠上僅有幾個(gè)有意義的蛋白質(zhì),，或者如果其他技術(shù)無(wú)法測(cè)定而克隆其基因是必需的,，則需要進(jìn)行泛化的Edman降解測(cè)序。
近來(lái),，應(yīng)用自動(dòng)化的Edman降解可產(chǎn)生短的N-末端序列標(biāo)簽,，這是將質(zhì)譜的序列標(biāo)簽概念用于Edman降解，業(yè)已成為一種強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)鑒定,。 當(dāng)對(duì)Edman的硬件進(jìn)行簡(jiǎn)單改進(jìn),，以迅速產(chǎn)生N-末端序列標(biāo)簽達(dá)10～20個(gè)/d，序列檢簽將適于在較小的蛋白質(zhì)組中進(jìn)行鑒定,。若聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)屬性,，如氨基酸組分分析、肽質(zhì)質(zhì)量,、表現(xiàn)蛋白質(zhì)分子量,、等電點(diǎn)，可以更加可信地鑒定蛋白質(zhì)。 選擇BLAST程序,，可與數(shù)據(jù)庫(kù)相配比,。 目前，采用一種Tagldent的檢索程序,，還可以進(jìn)行種間比較鑒定,，又提高了其在蛋白質(zhì)組研究中的作用。
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