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單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序簡介：10x Genomics 是基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞系統(tǒng),，可同時獲得100-800000個細(xì)胞的表達(dá)信息,，實現(xiàn)對細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測，是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性,、免疫細(xì)胞群體檢測以及胚胎發(fā)育研究的黃金方法,。10xGenomics單細(xì)胞應(yīng)用廣泛，可應(yīng)用的細(xì)胞類型有：生殖細(xì)胞,，胚胎細(xì)胞,，神經(jīng)細(xì)胞，免疫細(xì)胞,，腫瘤細(xì)胞,，干細(xì)胞,，其他原代細(xì)胞,。

1  單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序實驗流程

1.1實驗流程圖

1.2實驗描述

1) 細(xì)胞質(zhì)檢RNA,，用Countess®II Automated Cell Counter對細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到理想濃度1×106/mL,。

2) 10x 標(biāo)記cDNA的片段,，含有barcode信息的凝膠珠子首先與細(xì)胞和酶的混合物結(jié)合,，然后被位于微流體'雙十字'連接中的油表面活性劑液滴包裹。液滴非常小,，僅能容納一個凝膠珠子,，液滴流到儲液器中被收集后，凝膠珠子溶解釋放引物序列,，逆轉(zhuǎn)錄cDNA的片段,，并以cDNA 為模板進行PCR 擴增。將每個液滴中含有barcode信息的產(chǎn)物混合,，構(gòu)建測序文庫,。

3) 建庫，首先利用Biorupter 超聲破碎儀將cDNA 打斷成200~300bp左右的片段,，加上測序接頭P5 和測序引物R1 等傳統(tǒng)二代測序的建庫過程,，后進行PCR擴增得到DNA 文庫。

4) 簇生成和測序,，利用Qubit 儀器對文庫進行定量,，合格的文庫被放置到cBot中進行橋式擴增，生成簇后利用Hiseq 或者Miseq測序儀進行測序,。原理是每個循環(huán)都加入A,，T，G,，C 4 種熒光基團標(biāo)記的dNTP,，依據(jù)AT、GC 配對,，對應(yīng)的dNTP通過1DNA 聚合酶結(jié)合到模板DNA 鏈上,，其他未結(jié)合的dNTP被洗脫掉，結(jié)合的位置釋放出熒光信號,，被計算機捕捉到并進行相應(yīng)轉(zhuǎn)換,，從而得到該位置的堿基信息。