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主營產(chǎn)品： 高血脂癥動(dòng)物模型,心血管疾病動(dòng)物模型,缺血性心臟病動(dòng)物模型 |
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2021-1-7 閱讀(7189)
一,、Western Blot實(shí)驗(yàn)為什么要用內(nèi)參?
Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少,，前提條件是等量的組織細(xì)胞蛋白上樣,，才有比較的基礎(chǔ)，特別是表達(dá)量不高時(shí),，上樣量的的差別就很有可能影響結(jié)果的分析,。因此，在Western Blot試驗(yàn)中,，進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè),，有以下兩點(diǎn)作用：
1、校正蛋白質(zhì)定量,、上樣過程中存在的誤差,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；
2,、使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否、整個(gè)Western Blot顯色發(fā)光體系是否正常,。
二,、你的內(nèi)參選對(duì)了嗎？
作為內(nèi)參的蛋白要符合的標(biāo)準(zhǔn),，可從以下幾方面入手：
1,、先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來源于什么物種。
樣本來源 | 選擇內(nèi)參 |
哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞 | β-actin,、β-tubulin,、GAPDH、Lamin B,、Histone H3,、Na,K atpase等 |
植物來源 | plant actin,、Rubisco |
其他來源樣本研究較少 | 應(yīng)參照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參,。 |
2,、內(nèi)參的檢測(cè)帶與那些目標(biāo)蛋白的檢測(cè)帶在分子量上有所不同；
選擇內(nèi)參抗體時(shí),，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小,。通常應(yīng)該目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD,，此時(shí)不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參,，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。
針對(duì)不同樣品制備常用的內(nèi)參以及它們的分子量
3,、要考慮目的蛋白表達(dá)部位
就一般的蛋白檢測(cè)來說,，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了,，而針對(duì)于核蛋白的定量,，特別是樣本蛋白就是核蛋白時(shí)，選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價(jià)值,。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A,、Lamin B、Histone H3,，除此之外,，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70,、K80等,，在一些文獻(xiàn)報(bào)道中，Erk2,、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun,、c-Fos等都有使用。而對(duì)于膜蛋白檢測(cè),，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase,。對(duì)于線粒體蛋白的檢測(cè)，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體,。
4,、實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境
有些細(xì)胞在某些條件下內(nèi)參表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常，使其不適合做內(nèi)參,。
①某些細(xì)胞中,，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高,，不適合做內(nèi)參,。
②在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí),，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。
③在加入抗癌和抗真菌藥物時(shí),，Tubulin的表達(dá)易受影響,，不適合作為內(nèi)參。
④Lamin B不適合作為胚胎干細(xì)胞的內(nèi)參,，而PCNA不適合作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等,。其他具體可查詢相應(yīng)文獻(xiàn)。
5,、不同的組織特異性
actin 即肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白,。actin 大致可分為六種,，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin,、alpha-cardiac muscle actin,、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的,，在肌肉組織中beta-actin分布就很少,，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參,。
三,、實(shí)驗(yàn)中使用內(nèi)參的方法你知多少？
在Western Blotting實(shí)驗(yàn)過程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種,。
1,、超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法，只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體,，按照正常操作即可,；
2、普通內(nèi)參,，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí),，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體,，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育,、顯色檢測(cè)。
3,、當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下,，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠?，使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開,，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行溫育,，二抗溫育以及顯色。
