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主營產(chǎn)品： 高血脂癥動物模型,心血管疾病動物模型,缺血性心臟病動物模型 |
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2021-1-7 閱讀(7340)
一,、Western Blot實驗為什么要用內(nèi)參?
Western Blot實驗結(jié)果進行內(nèi)參校正已成為一種慣例,。目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的組織細胞蛋白上樣,，才有比較的基礎(chǔ),，特別是表達量不高時，上樣量的的差別就很有可能影響結(jié)果的分析,。因此，在Western Blot試驗中,，進行內(nèi)參的檢測,，有以下兩點作用：
1、校正蛋白質(zhì)定量,、上樣過程中存在的誤差,，實驗結(jié)果的準確性；
2,、使用內(nèi)參可以作為空白對照,，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否,、整個Western Blot顯色發(fā)光體系是否正常。
二,、你的內(nèi)參選對了嗎,？
作為內(nèi)參的蛋白要符合的標準，可從以下幾方面入手：
1,、先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種,。
樣本來源 | 選擇內(nèi)參 |
哺乳動物組織或細胞 | β-actin、β-tubulin,、GAPDH,、Lamin B、Histone H3,、Na,K atpase等 |
植物來源 | plant actin,、Rubisco |
其他來源樣本研究較少 | 應(yīng)參照文獻報導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參,。 |
2,、內(nèi)參的檢測帶與那些目標蛋白的檢測帶在分子量上有所不同；
選擇內(nèi)參抗體時,，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小,。通常應(yīng)該目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量為45KD,，此時不適宜選擇β-actin作為內(nèi)參,，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內(nèi)參。
針對不同樣品制備常用的內(nèi)參以及它們的分子量
3,、要考慮目的蛋白表達部位
就一般的蛋白檢測來說,，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了,，而針對于核蛋白的定量,，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價值,。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A,、Lamin B、Histone H3,，除此之外,，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70,、K80等,，在一些文獻報道中，Erk2,、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun,、c-Fos等都有使用,。而對于膜蛋白檢測，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase,。對于線粒體蛋白的檢測,，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。
4,、實際的實驗環(huán)境
有些細胞在某些條件下內(nèi)參表達會出現(xiàn)異常,，使其不適合做內(nèi)參。
①某些細胞中,，由于組織缺氧,、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達增高，不適合做內(nèi)參,。
②在凋亡實驗時,，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。
③在加入抗癌和抗真菌藥物時,，Tubulin的表達易受影響,，不適合作為內(nèi)參。
④Lamin B不適合作為胚胎干細胞的內(nèi)參,，而PCNA不適合作為非增殖細胞的內(nèi)參等,。其他具體可查詢相應(yīng)文獻。
5,、不同的組織特異性
actin 即肌動蛋白,，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種,，其中四種是不同肌肉組織特異性的,，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin,、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin,。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少,，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin,。因此不同的組織本來就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參。
三,、實驗中使用內(nèi)參的方法你知多少,？
在Western Blotting實驗過程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種。
1,、超級簡便的標記內(nèi)參使用法，只要在二抗孵育時加入HRP標記內(nèi)參抗體,，按照正常操作即可,；
2,、普通內(nèi)參，當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時,，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測,，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內(nèi)參蛋白的抗體溫育,、顯色檢測,。
3、當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下,，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染,，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開,，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育,，二抗溫育以及顯色。
