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Rat eNOS-3ElisaKit

本試劑僅供研究使用  標本：血清或血漿及相關液體

原理：

采用雙抗體夾心法測定MTHFD2水平,。用純化的MTHFD2抗體包被微孔板,，制成固相載體，實驗時依次在微孔板中加入樣本及標準品,，并加入 HRP 標記的 ABP 抗體，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,，反復洗滌后加底物 TMB 顯色,。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，再用硫酸終止反應,，轉變成黃色,。顏色的深淺和樣品中的 ABP含量呈正相關。采用酶標儀在 450nm 波長測定吸光度（OD 值）,，根據標準曲線,，計算測試樣品中 ABP 濃度。

試劑盒組成：

性能:

1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應,。

3. 重復性：板內,、板間變異系數均小于10%。

結果判斷與分析:

1,、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的待測物質標準品濃度為橫坐標（X）,，做得相應的曲線,，樣品的待測物質含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

操作步驟：

1. 取出試劑盒,，室溫（20-25℃）放置 30 分鐘,。

2. 分組：取出 96 孔板,，根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理,。分別設標準

品組（6 個濃度）,、空白孔、待測樣品組,。

注：為減少實驗誤差,，保證準確性，建議設置復孔,。

3. 加樣：依照標準品的順序分別加入 50ul 的標準品溶液于空白微孔中,；空白對照孔加入 50ul 的蒸餾水；其余微孔中加入 50ul

的待測樣本,。

4. 加酶標溶液：標準品組,、待測樣本組各孔中加入 100ul 的酶標溶液（空白對照孔除外）。

5. 溫育：酶標板用封板紙密封后,，放入濕盒內于 37℃恒溫孵育 1 小時,。

6. 洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置 15-30s,，充分清洗酶標板 5 次,，用吸水紙拍干。

7. 顯色：各孔加入顯色劑 A 液 50ul 后,，再加入顯色劑 B 液 50ul,。

8. 終止：25-37℃下避光反應 10-15 分鐘，加入 50ul 終止液,。

9. 讀板：在 450nm 波長讀取各孔的 OD 值,。
ELISA試劑盒為什么要嚴格按照說明書操作？

一.先說最嚴重的操作錯誤,，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書,，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當作雙抗體夾心法來做,，導致的結果就是整板顯示很強的藍色,，無任何梯度。

二.混用別的試劑盒里的試劑,。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒,，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導致的結果是,，浪費珍貴的樣本,，樣品的回收率達不到預期值，如果混用不同試劑盒的酶復合物，會導致顯色過弱或過強,，因為每種試劑盒所用酶復合物效價可能不一樣,。

三.不看文獻或者不做預實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應該1:10稀釋,，結果稀釋成1:1000,，導致的結果是顯色過弱，結果不可用,。

車.不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度,。導致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適,，實驗帶來誤差,。

五.洗滌不充分，每孔洗液加樣過少,，或者殘留,。導致的結果是顯色過快，同時背景較高,。

六.手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液,，導致洗液污染，整個實驗失敗,。

七.剩余酶標板條未及時放入干燥袋,，導致酶標板受潮，下一次再做時,，顯色過弱或污染，CV值過高,。

八.試劑盒保存條件不當,。試劑盒要求放4℃的，放在了-20℃,?；蛘咭蠓?20℃的，放在了4℃,。均會導致試劑盒敏感性下降,。

以上只是最常見的操作錯誤。順利完成一次ELISA實驗需要注意的細節(jié)很多,，許多操作環(huán)節(jié)都影響到檢測的質量,。

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