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商品屬性：

產(chǎn)品名稱：海藻糖6磷酸合成酶(TPS)生化檢測(cè)試劑盒

規(guī)格：100管/96樣 50管/48樣 

貨號(hào) : EY-01S1229

測(cè)試方法:微量法　紫外分光光度法　　

分類：蔗糖系列

商品詳情：

測(cè)定意義：

海藻糖是由兩個(gè)糖分子以α,，α-1-1 糖苷鍵連接而成的一種非還原雙糖,，廣泛存在于細(xì)菌,、酵母菌,、霉菌、食用菌,、低等植物,、昆蟲、無脊椎動(dòng)物和高等植物等多種有機(jī)體中,。海藻糖的非還原性決定了它對(duì)酸,、堿、高溫等的穩(wěn)定性,。另外,，它本身具有很強(qiáng)的吸水性,，使它在生物體內(nèi)具有抗脫水作用，在逆境條件下可通過識(shí)別外界刺激,、產(chǎn)生和傳遞信號(hào),、基因表達(dá)和代謝調(diào)節(jié)來保護(hù)植物免受不良環(huán)境的傷害。

植物體內(nèi)主要以糖為底物合成海藻糖,，該反應(yīng)首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸糖（UDPG）和 6-磷酸糖反應(yīng)生成中間產(chǎn)物6-磷酸海藻糖,，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 （trehalose6-phosphate phosphatase,，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖,。因此,，測(cè)定TPS活性對(duì)于研究植物逆境具有重要意義。

測(cè)定原理：

TPS 催化 UDPG 與 G6P 生成海藻糖-6-磷酸,，同時(shí)產(chǎn)生 UDP,；UDP 在丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶作用下，氧化 NADH 為 NAD+,，NADH 的下降速率與 UDP 含量成正比,，通過 340nm 吸光度下降速率反映 TPS 活性。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、96 孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/p>

1,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。16000g,，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè),。

2,、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；16000g,， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測(cè),。

3,、血清等液體：直接測(cè)定。

ADH測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到340 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min,。

3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL樣本上清液,、800μL試劑三和100μL試劑四，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化,，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值,，分別記為A1和A2?！鰽測(cè)定管=A1-A2,。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、將試劑二在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中,，混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2,，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5,，需將樣本用提取液稀釋,，使A1-A2小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度,。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。

NAD-MDH活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）NAD-MDH活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA

2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD-MDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=3.215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，8×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，1 min；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，2000萬。

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