的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件,。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異,，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式點,。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點,，珠式、管式及磁性球ELSIA,，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用,，兩者均有詳細的使用說明，嚴格遵照規(guī)定操作,，必能得出準確的結(jié)果,。
一、標本的采取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛,，體液（如血清）,、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份,。有些標本可直接進行測定（如血清,、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）,。大部分ELISA檢測均以血清為標本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清,。制備血漿標本需借助于抗凝劑,，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得,。除特殊情況外,，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用,。血清標本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP為標記的ELISA測定中,，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
血清標本宜在新鮮時檢測,。如有細菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久,，其中的可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來,，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存,。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均,，應(yīng)充分混勻宜輕緩,，避免氣泡,，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強烈振蕩,?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫?yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測,。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作,，也可加入適當防腐劑,。
二、試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用,。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存,。
三、加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本,，加酶結(jié)合物,，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡,。加標本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器,，使加液過程迅速完成。
四,、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育,，在ELISA中似不恰當,。
ELISA屬固相免疫測定，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。
溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時,，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中,，以形成zui多的沉淀,。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用,。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中,，ELISA板底應(yīng)貼著水面,，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上,。若用保溫箱,，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布,，zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此,。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育,。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可,。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確,。為保證這一點，一個人操作時,，一次不宜多于兩塊板同時測定,。
五、 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,，但卻也決定著實驗的成敗,。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,。可以說在ELISA操作中,，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴格按要求洗滌,，不得馬虎,。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種,，過程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液,；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）,；c.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘,，間歇搖動,，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體,。吸干應(yīng)*,，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干,；e.重復(fù)操作c和d,，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間,。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法,。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團,，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法zui初用于小珠載體的洗滌,，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水,。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗,，持續(xù)沖洗2分鐘后,，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘,，吸干即可,。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴,，其洗滌效果更為*,，且也簡便、快速,。已有實驗表明,，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓,，讓水流沖擊板孔表面,，洗滌效果更佳。
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