ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗,,是一種常用的固相酶免疫測定方法,。ELISA的基本原理是:
①使抗原(或抗體)結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性,;
②使抗原(或抗體)與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原(或抗體),而且此酶標(biāo)抗原(或抗體)既保留其免疫活性,,又保留其酶活性,;
③測定時將受檢標(biāo)本(抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原(或抗體)按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進行反應(yīng),再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開,zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例,;再加入酶反應(yīng)底物后,,底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物,根據(jù)其顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析,,以了解被測標(biāo)本中抗體或抗原含量,。
elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多,,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,,在臨床檢驗中除正常反應(yīng)外,有時??梢姷揭恍╁e誤結(jié)果(即假陽性或假陰性結(jié)果),。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有:
①標(biāo)本因素;
②試劑因素,;
③操作因素,。
現(xiàn)就標(biāo)本因素對ELISA測定的影響做如下討論。
血清是zui常用的ELISA標(biāo)本,,血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本,,標(biāo)本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致,分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種:
1,、內(nèi)源性物質(zhì) 有人認為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),,可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有:類風(fēng)濕因子,、補體,、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體,、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s)抗體,、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。
(1)類風(fēng)濕因子
人血清中IgM,、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合,,從而導(dǎo)致假陽性。
解決該情況的辦法是:
①用F(ab)2替代完整的IgG,;
②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性(63℃,,10 min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效);
③檢測抗原時,,可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中,,使RF降解。
(2)補體 ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中,,抗體分子發(fā)生變構(gòu),,其FC段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露出來,,使C1q 可以將二者連接起來,從而造成假陽性,。解決的辦法是:①用EDTA稀釋標(biāo)本,;②用53℃,10 min或56℃,,30 min加熱血清使C1q滅活,。
(3)嗜異性抗體 人類血清中含有能與嚙齒類動物(如鼠等)Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體,可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來,,也能造成假陽性,。解決的辦法是:可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig (s) ,但加入量不足或亞類不同時無效,。
(4)嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白,、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體,有時能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物,,在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果,。為避免以上情況出現(xiàn),解決的辦法是:測定前需用理化方法將其解離后再測定,。
(5)醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s) 抗體 臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療,,用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù),均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體,;另外,,被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性,。解決的辦法是:測定抗原時,,在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig (s) ,從而克服由于上述原因造成的假陽性,。
(6)交叉反應(yīng)物質(zhì) 類地高辛,、類AFP樣物質(zhì)等,是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì),。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大,,但在用單克隆抗體測定抗原時,如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應(yīng)的靶決定簇時,,也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。
(7)標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過高、膽紅素,、血紅蛋白及血液粘度過大等,,均對ELISA測定結(jié)果有干擾作用。
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