微小殘留病(minimal residual disease，MRD)一般是指白血病患者在經(jīng)過治療后體內(nèi)殘存白血病細胞的狀態(tài),，被認為是白血病復(fù)發(fā)及影響預(yù)后的主要原因,。廣義而言，此含義還可包括其他惡性腫瘤,。MRD被認為是在傳統(tǒng)檢測方法所能檢測到的腫瘤細胞水平以下的長期存在的腫瘤細胞,，這些腫瘤細胞一旦增殖到一定程度能引起復(fù)發(fā)。因此,，有效利用MRD檢測能夠很好地指導(dǎo)治療以增加*,，提高療效，特別是對HSCT的療效評估方面也有重要的意義,。
MRD的檢測方法
MRD的檢測方法很多,，主要有細胞形態(tài)學(xué)、細胞遺傳學(xué),、FISH,、流式細胞儀和PCR等方法。各種檢測MRD方法應(yīng)用情況及其優(yōu)缺點的比較,。
1.形態(tài)學(xué)方法
常用方法包括骨髓穿刺和骨髓活檢,。常規(guī)骨髓穿刺涂片檢查法對臨床白血病的診斷、療效觀察,、復(fù)發(fā)判斷仍具有很重要的作用,，但形態(tài)學(xué)上尚不能真正區(qū)分正常細胞與白血病細胞，只是依據(jù)原始細胞百分比進行判斷,。即使在實體瘤患者中,，通過組織細胞學(xué)檢測仍不能敏感地反映腫瘤細胞的存在情況,。而孤立的腫瘤細胞極易進入靜止期而不易被檢測到。實體瘤或急性白血病患者的類似孤立的細胞可通過多部位采集涂片檢查而增加陽性檢出率,，但zui終還需要更敏感,、更客觀的檢測手段來證實。
白血病*緩解后骨髓活檢檢查 MRD預(yù)測判斷復(fù)發(fā)要比穿刺涂片更敏感些,，尤其是切片上發(fā)現(xiàn)呈斑點狀的原始細胞,，應(yīng)高度懷疑白血病復(fù)發(fā)的可能?？傊?，骨髓形態(tài)學(xué)方法對于檢查MRD一般來說不夠敏感，只有當(dāng)體內(nèi)白血病細胞>109時才有意義,。但是細胞形態(tài)學(xué)方法仍為判斷白血病狀態(tài)的重要方法,。
2.體外熒光原位雜交技術(shù)
對于血液腫瘤中非隨機的細胞遺傳學(xué)的認識，促進了對疾病病原學(xué)的認識,。新的異常染色體的發(fā)現(xiàn)有利于促進白血病的分類,，特別是某些染色體的異常可作為判斷預(yù)后的重要指標(biāo),。
傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)分析的敏感性受處于分裂中期的染色體的數(shù)量所限制,，而且很少應(yīng)用于MRD的研究上。與白血病相關(guān)的細胞遺傳學(xué)改變可預(yù)測復(fù)發(fā),，而無類似的改變也不能排除復(fù)發(fā)。因此,，傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)的分析耗時,、費力，且對檢測者水平要求比較高,。
FISH是一種較傳統(tǒng)細胞遺傳學(xué)更為特異,、敏感、方便的方法,。它是指在細胞內(nèi)用熒光標(biāo)記的DNA探針與染色體雜交,，它可用分裂期的細胞作為研究對象，包括中期FISH和間期FISH,，二者均可用于分析異常染色體的數(shù)量和結(jié)構(gòu),，而間期FISH不需要培養(yǎng)細胞，可同時進行免疫分型和基因分型,，更多地應(yīng)用于分析具有細胞遺傳學(xué)異常的細胞的比例,。
FISH可應(yīng)用于以下情況:①獲取或丟失整條染色體或腫瘤特異染色體區(qū)域;②檢測單基因的缺失和重排;③定義一些用傳統(tǒng)細胞遺傳學(xué)方法無法明確的染色體異位;④揭示一些特殊的、異常的復(fù)雜核型;⑤評估致癌基因或腫瘤超基因的拷貝數(shù);⑥監(jiān)測患者的臨床過程,，如性別不合的HSCT,。
3.流式細胞儀
流式細胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)是一種對處在液流中的細胞或其他生物微粒逐個進行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù),。FCM可同時分析多種細胞參數(shù)(如細胞形態(tài),、活力和免疫表型)，還能用熒光位點雜交來進行 MRD的研究,。因此,，流式細胞儀作為當(dāng)前的研究MRD的儀器，是因為它能同時區(qū)分多熒光染料,，從而使MRD檢測更加方便和更為有效,。
FCM對MRD檢測的敏感性取決于所要檢測的細胞數(shù)量及目標(biāo)細胞與非目標(biāo)細胞在形態(tài)上和表型上的區(qū)別程度。在理想條件下,，大于1/107個細胞的目標(biāo)細胞可用流式細胞儀檢測到,，而1/106的目標(biāo)細胞能清楚地被檢測到。當(dāng) MRD被用于臨床時,，不同標(biāo)記的目標(biāo)細胞的數(shù)量較低,，10～20個集落細胞可用于解釋流式的信號，從而使MRD的敏感性增加到1/104,。
4.聚合酶鏈反應(yīng)
聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain eraction,，PCR)是一種在體外擴增DNA片段的重要技術(shù)。當(dāng)存在模板DNA,、底物,、上下游引物和耐熱的DNA聚合酶時，經(jīng)過多次“變性—復(fù)性—延伸反應(yīng)”的循環(huán)過程;痕量模板DNA可擴增至幾百萬倍,。因此用PCR進行MRD檢測是極為合適的,，并使 MRD的檢測方法有了突破性的進展。現(xiàn)有的PCR方法包括RNA-PCR,、反向PCR,、引物標(biāo)記PCR、實時PCR(RT-PCR)和實時定量PCR(RQ-PCR),。
PCR方法擴增的腫瘤特異核苷酸序列包括染色體易位的斷裂點結(jié)合區(qū),、患者特異的抗原受體基因重排序列和異常表達的基因。PCR檢測MRD的敏感度已達到1/107～1/106,，使MRD的檢出率大大提高,，這種方法是目前臨床研究 MRD的主要手段之一。PCRzui大的限制是污染影響了其敏感性,。預(yù)防污染發(fā)生就要防止由于污染而導(dǎo)致的假陽性,，特別是由于一些特殊擴增物質(zhì)延續(xù)而產(chǎn)生的結(jié)果。
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