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一,、標(biāo)本制作

可制作涂片、印片,、細(xì)胞單層培養(yǎng)物,、組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定,，作免疫熒光染色用,。

二、熒光抗體染色方法

（一）直接法

1．染色 切片經(jīng)固定后,，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min,，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi),，防止干燥。
2．洗片 　傾去存留的熒光抗體,，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次,，攪拌，每次5min,，再用蒸餾水洗1min,，除去鹽結(jié)晶。
3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固,、鏡檢
4．對(duì)照染色

①正常免熒光血清染色,，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性,。②染色抑制試驗(yàn)（一步法）：將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合,，如上法處理切片,。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致,，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清,，染色結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定,。③類(lèi)屬抗原染色試驗(yàn),，前面已作敘述。

直接法比較簡(jiǎn)單,，適合做細(xì)菌,、螺旋體、原蟲(chóng),、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究,。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原,，特異性高而敏感性較低,。

（二）間接法

（1）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度,，37℃作用30min,。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min,，用吸水吸去或吹干余留的液體。

（2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等）,，同上步驟,，染色30min，37℃,，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌,，緩沖甘油封固，鏡檢,。

對(duì)照染色：①抗體對(duì)照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清,，再用上法進(jìn)行染色,，結(jié)果應(yīng)為陰性,。②抗原對(duì)照：即類(lèi)屬抗原染色,，亦應(yīng)為陰性。③陽(yáng)性對(duì)照,。

間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）,。另一種稱夾心法，即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合,，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上,，而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在，方法步驟如下：