組織塊直接培養(yǎng)法(原代細胞培養(yǎng)實驗)
材料與儀器
【動物】選擇大約一半足孕時間的胚胎,10-13天齡胚胎含有最大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細胞,,成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得,。每組小鼠胚胎1個
【實驗材料】每組的超凈臺中有以下物品:
1、50ml配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶;8ml小牛血清(FCS)1瓶,;100ml 0.25%瓶,;PBS(-)1瓶
2、100ml滅菌燒杯2個
3,、50ml離心筒2個
4,、滅菌培養(yǎng)皿1個,細胞培養(yǎng)瓶1個
5,、1ml,,200μl移液器各1支;槍頭盒2個,;無菌玻璃攪拌棒1個
6,、細胞計數(shù)板1塊
7、滅好菌的鑷子1把,,剪刀1把
8,、酒精燈1臺
步驟:
1) 胚胎的分離。適用哺乳動物(倉鼠,、小鼠和大鼠),。
2)將1-2個胚胎轉(zhuǎn)移至一個小的無菌培養(yǎng)皿中,用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎,,用PBS漂洗,。
3)在無菌狀態(tài)下,將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一50ml的無菌離心筒中,加入40ml 0.25%的無菌,用攪拌棒輕輕攪動,。
4)在溫暖的環(huán)境中或置于37°C培養(yǎng)箱中輕輕搖動15分鐘,。
5)讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降,將含有懸浮細胞的液體轉(zhuǎn)移至一無菌50ml的離心管中,,該管內(nèi)按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以滅活,,。
6)加人新鮮溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來的50ml離心筒中,重復(fù)步驟4和5,。
7)離心混合的細胞懸液,,1200r/rain,5分鐘,,棄上清,。
8)用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細胞,按步驟7再次離心,。
9)用PBS反復(fù)洗滌細胞直至上清清亮為止。
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