PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,；
②堿基配對(duì)原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性,。
PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，產(chǎn)品僅用于科研按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5μl dNTP mix （2mM）
4μl 引物1（10pM）
2μl 引物2（10pM）
2μl Taq酶 （2U/μl）
1μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min,，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min,。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油,，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油；否則,，直接取5-10μl電泳檢測(cè),。
注意事項(xiàng):
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行，設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室,。
2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響,。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果,，純化的方法越簡單越好,。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染，產(chǎn)品僅用于科研操作過程中均應(yīng)戴手套,。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,，試驗(yàn)一下是否滿意,，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性,。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,，并且要充分混勻,。
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