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流感病毒N2亞型核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）反應(yīng)流程常規(guī)程序:

將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后,，在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性,，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán),。在每一個(gè)循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性,，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般50-60℃之間）,，一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火,；在72℃保持1分鐘（擴(kuò)增1kb片段）,，使引物在模板上延伸，合成DNA,，完成一個(gè)循環(huán),。重復(fù)這樣的循環(huán)25～35次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積,。最后,，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整,，4℃保存,。

2．復(fù)性（退火）和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間,。具體的溫度主要由引物的Tm值決定,。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高,，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度,，變成二步法PCR。

3．反應(yīng)時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘,，如果模板的G+C含量較高,，或直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng),。復(fù)性時(shí)間有30秒種一般是足夠的,。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時(shí)間。

4．循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān),，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級(jí)時(shí),，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過程后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象,。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低,，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用,，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用,，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不ce底,。

5．PCR反應(yīng)液的配制

PCR反應(yīng)體系的配置方式有時(shí)也會(huì)影響反應(yīng)的正常進(jìn)行,。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在最后加入DNA聚合酶,。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā),。

對(duì)于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí),，有時(shí)會(huì)擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問題時(shí),，如果將反應(yīng)成分分開配制,，A管含模板、引物和dNTP,，以及調(diào)整體積的H2O,，B管含緩沖液,、DNA聚合酶和水,，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個(gè)問題,。

無水磷酸三鈉/三堿式磷酸鈉/原磷酸三鈉/磷酸三鈉/磷酸鈉/Trisodium phosphateAR,，98%，500克國產(chǎn)/進(jìn)口

2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二羧酸鈉/4,4-二羧基-2,2-聯(lián)喹啉二鈉/2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉/BCABR,，98%5克國產(chǎn)/進(jìn)口

D(-)酒石酸鈉/酒石酸鈉/D-酒石酸鈉/2,3-二羥基丁二酸鈉/D-(+)-Tartaric acid disodium saltAR,，99%500克國產(chǎn)/進(jìn)口

L(-)酒石酸鈉/酒石酸鈉/L-酒石酸鈉/L-(+)-Tartaric acid disodium saltAR，99%500克國產(chǎn)/進(jìn)口

偏釩酸鈉/二水偏釩酸鈉/釩酸鈉/Sodium metavanadate dihydrateAR,，99.9%,，25克國產(chǎn)

無水偏釩酸鈉/釩酸鈉/Sodium metavanadateAR，99%,，25克國產(chǎn)/進(jìn)口

四苯硼鈉/四苯基硼酸鈉/四苯硼酸鈉/NaTBPAR,；99%，10克國產(chǎn)/進(jìn)口

氟化鈉/Sodium fluorideGR，99%,，500克國產(chǎn)

氫氧化鈉/苛性鈉/燒堿/鈉氧條/苛性曹達(dá)/固堿/火堿/Sodium hydroxideGR,，97%，500克國產(chǎn)

氟硼酸鈉/四氟硼鈉/四氟硼酸鈉/Sodium fluoroborateCP,，98%,，500克國產(chǎn)

六偏磷酸鈉/偏磷酸六鈉/格來漢氏鹽/卡甘/磷酸鈉玻璃/格臘哈姆鹽/六偏/六聚偏磷酸鈉/Sodium hexametaphoshpateCP，95%500克國產(chǎn)/進(jìn)口

萘酚AS-MX磷酸鹽/色酚AS-MX磷酸鹽/磷酸萘酚AS-MX/Naphthol AS-MX phosphate高純,，99%500毫克國產(chǎn)/進(jìn)口

萘酚AS-BI磷酸二鈉/萘酚磷酸鈉/7-溴-N-(2-甲氧基苯基)-3-(磷酸氧基)萘-2-甲酰胺二鈉鹽/Naphthol AS-BI phosphate disodium saltBR,，99.5%100毫克國產(chǎn)/進(jìn)口

單硬脂酸甘油酯/硬脂酸甘油酯/單甘酯/甘油單硬酯酸酯/十八酸甘油酯/GMSCP100克國產(chǎn)/進(jìn)口

丁二酸二甲酯/琥珀酸二甲酯/琥珀酸甲酯/Dimethyl succinateCP，98%100毫升國產(chǎn)/進(jìn)口

乙酰乙酸甲酯/乙酰醋酸甲酯/丁酮酸甲酯/β-丁酮酸甲酯/3-丁酮酸甲酯/MAACP,，98%500毫升國產(chǎn)/進(jìn)口

對(duì)羥基苯甲酸甲酯/尼泊金甲酯/4-羥基苯甲酸甲酯/對(duì)羥基安息香酸甲酯/泊金M/尼泊金/Methyl 4-hydroxybenzoateCP,，98.5%100克國產(chǎn)/進(jìn)口