1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,,每孔加0.1ml,4℃過夜,。
2.次日洗滌3次,。
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白,、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中,,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,,洗滌,最后一遍用DDW洗滌,。
4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘,。
5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。
6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,,陽性程度越強(qiáng),,陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,,以“+”,、“-”號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,,于450nm(若以ABTS顯色,,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,,即為陽性。
雙抗原夾心法檢測抗體
雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似,。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,,以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體,。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,,可直接用于測定,,因此其敏感度相對高于間接法,。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法,。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,,尋找合適的標(biāo)記方法,。
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