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蛋白膠微量回收試劑盒操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理,。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞,，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,，不取決于細(xì)胞數(shù),。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞,，每5-10×106動物,、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol,，反復(fù)吸打,。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理,。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘,，使核酸蛋白復(fù)合物*分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì),，脂肪,，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘,，取上清,。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖,，高分子量DNA,，上清中含有RNA。處理脂肪組織時,，上層有大量油脂應(yīng)去除,。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯fang,，劇烈振蕩15秒,，室溫放置3分鐘,。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相,，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅,。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相,，進一步操作見后,。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,，室溫放置10分鐘,。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀,，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀,。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀,。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇,。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清,。
10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低,。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液,。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存,。