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的試劑,，良好的儀器和正確的操作是保證elisa 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA 的操作因固相載體的形成不同而有所差異,，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均用板式點(diǎn),。本文將敘述板式ELISA 各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn)，珠式,、管式及磁性球ELSIA ，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用,，兩者均有詳細(xì)的使用說明,，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,。

1 保溫

在 ELISA 中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,，這一保溫過程稱為溫育(incubation) ，有人稱之為孵育,，在ELISA 中似不恰當(dāng),。

ELISA 屬固相免疫測(cè)定，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì),，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn),。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA 反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。溫育常采用的溫度有 43℃,、37℃,、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELI SA 方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時(shí),，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中,，以形

2 標(biāo)本的采取和保存

可用作 ELISA 測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛,，體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液,、糞便)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份,。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清、尿液),，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物),。大部分ELISA 檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,，其他成份均同等于血清,。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固,、收縮后即可取得,。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本,。在ELISA 中血漿和血清可同等應(yīng)用,。

血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血,，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP 為標(biāo)記的ELISA 測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色,。

3 試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑,。 ELISA 中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH 計(jì)測(cè)量較正,。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存,。

4 加樣

在 ELISA 中一般有3 次加樣步聚,，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物,，加底物,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡。

加標(biāo)本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測(cè)定(如間接法 ELISA )需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1 分鐘以保證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成,。