的試劑,，良好的儀器和正確的操作是保證elisa 檢測結(jié)果準確可靠的必要條件,。ELISA 的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學檢驗一般均用板式點,。本文將敘述板式ELISA 各個操作步驟的注意要點,，珠式、管式及磁性球ELSIA ,，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用,，兩者均有詳細的使用說明，嚴格遵照規(guī)定操作,，必能得出準確的結(jié)果,。
1 保溫
在 ELISA 中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標本和加酶結(jié)合物后,?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation) ,，有人稱之為孵育,，在ELISA 中似不恰當。
ELISA 屬固相免疫測定,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA 反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。溫育常采用的溫度有 43℃、37℃,、室溫和4℃(冰箱溫度)等,。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELI SA 方法作反應(yīng)動力學研究時,，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達,。為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度,。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*,，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中,，以形
2 標本的采取和保存
可用作 ELISA 測定的標本十分廣泛，體液(如血清),、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液,、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定(如血清,、尿液)，有些則需經(jīng)預處理(如糞便和某些分泌物),。大部分ELISA 檢測均以血清為標本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清,。制備血漿標本需借助于抗凝劑,，而血清標本只要待血清自然凝固、收縮后即可取得,。除特殊情況外,，在醫(yī)學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA 中血漿和血清可同等應(yīng)用,。
血清標本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP 為標記的ELISA 測定中,，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
3 試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑,。 ELISA 中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH 計測量較正,。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存,。
4 加樣
在 ELISA 中一般有3 次加樣步聚,，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物,。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA 板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。
加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測定(如間接法 ELISA )需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標本,，然后在微型震蕩器上震蕩1 分鐘以保證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器,，使加液過程迅速完成,。
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