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HRP分子中與酶活性無關(guān)的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基,，再與抗體蛋白的氨基形成Schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián),，在標記前先用2,，4-二硝基氟苯（DNFB）封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后,，再加入硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的結(jié)合物,。

（1） 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸鹽緩沖液1ml中,，加入1%DNFB無水乙醇溶液0.1ml,，室溫下輕微攪拌1h；
（2） 加入新鮮配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml,，此時溶液由原棕色變?yōu)槟G色,，置4℃放置30min，此時溶液由原棕色變?yōu)槟G色,；
（3） 加入2.5%乙二醇1ml,， 室溫下輕微攪拌1h，終止反應(yīng),；
（4） 加入待標記的抗體5-10mg,， 用1.0mol/L,， pH9.5 CBS，調(diào)節(jié)pH值至9.0,；
（5） 混勻,，置4℃改良過碘酸鈉標記法制備酶標抗體
（6） 加入硼氫化鈉溶液0.1ml，混勻,，4℃放置3h,；
（7） 對0.01mol/L，pH7.4 PBS,，4℃透析,，換液3次；
（8） 3000r/min離心30min,，去除沉淀物,；
（9） 收集上清液即為酶標記抗體。

【注意事項】
（1） 在氧化HRP時,，以pH5.6醋酸鹽緩沖液溶解酶為宜,。
（2） 一般認為氧化HRP 5mg， NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為宜,，不能低于0.015mol/L 0.5ml,。
（3） 氧化HRP時間以15-30min為宜。
（4） 加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基,。
（5） 加入乙二醇的目的是終止反應(yīng),；為便于在加入抗體后調(diào)pH值，故乙二醇要用0.05mol/L CBS配制,。
改良過碘酸鈉標記法制備酶標抗體