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多肽合成的基本原理是什么,？
閱讀：1479 發(fā)布時(shí)間：2022-5-12
多肽合成又叫肽鏈合成,，是一個(gè)固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成,。過去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法,。合肥合生生物多肽的合成主要分為兩條途徑:化學(xué)合成多肽和生物合成多肽。
多肽合成的原理
多肽合成就是如何把各種氨基酸單位按照天然物的氨基酸排列順序和連接方式連接起來,。由于氨基酸在中性條件下是以分子內(nèi)的兩性離子形式(H3+NCH(R)COO-)存在,，因此，氨基酸之間直接縮合形成酰胺鍵的反應(yīng)在一般條件下是難于進(jìn)行的,。
氨基酸酯的反應(yīng)活性較高,。在100℃下加熱或者室溫下長(zhǎng)時(shí)間放置都能聚合生成肽酯，但反應(yīng)并沒有定向性,，兩種氨基酸a1和a2的酯在聚合時(shí)將生成a1a2…,、a1a1…、a2a1…等各種任意順序的混合物,。
為了得到具有特定順序的合成多肽,，采用任意聚合的方法是行不通的,，合肥合生生物而只能采用逐步縮合的定向多肽合成方法。一般是如下式所示,，即先將不需要反應(yīng)的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來,，然后再進(jìn)行連接反應(yīng)，以保證多肽合成的定向進(jìn)行,。
式中的X和Q分別為氨基和羧基的保護(hù)基,，它不僅可以防止亂接副反應(yīng)的發(fā)生，還具有能消除氨基酸的兩性離子形式,，并使之易溶于有機(jī)溶劑的作用,。
Q在有的情況下也可以不是共價(jià)連接的基團(tuán)，而是由有機(jī)強(qiáng)堿(如三乙胺)同氨基酸的羧基氫離子組成的有機(jī)陽(yáng)離子,。Y為一強(qiáng)的吸電子基團(tuán),，它能使羧基活化，而有利于另一氨基酸的自由氨基,，對(duì)其活化羧基的羧基碳原子進(jìn)行親核進(jìn)攻生成酰胺鍵,。
由此所得的連接產(chǎn)物是N端和C端都帶有保護(hù)基的保護(hù)肽，要脫去保護(hù)基后才能得到自由的肽,。如果肽鏈不是到此為止,，而是還需要從N端或C端延長(zhǎng)肽鏈的話，則可以先選擇性地脫去X或Q,，然后再同新的N保護(hù)氨基酸(或肽)或C保護(hù)的氨基酸(或肽)進(jìn)行第二次連接,，并依次不斷重復(fù)下去，直到所需要的肽鏈長(zhǎng)度為止,。
對(duì)于長(zhǎng)肽的多肽合成來說,，一般有逐步增長(zhǎng)和片段縮合兩種伸長(zhǎng)肽鏈的方式，前者是由起始的氨基酸(或肽)開始,。每連接一次,，接長(zhǎng)一個(gè)氨基酸，后者則是用N保護(hù)肽同C保護(hù)肽縮合來得到兩者長(zhǎng)度相加的新的長(zhǎng)肽鏈,。
對(duì)于多肽合成中含有谷氨酸、天冬氨酸,、賴氨酸,、精氨酸、組氨酸,、半胱氨酸等等帶側(cè)鏈功能團(tuán)的氨基酸的肽來說,，為了避免由于側(cè)鏈功能團(tuán)所帶來的副反應(yīng)，一般也需要用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基將側(cè)鏈基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來。
多肽合成方法分類
多肽的合成主要分為兩條途徑:化學(xué)合成多肽和生物合成多肽,。
化學(xué)合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來進(jìn)行,。在合成含有特定順序的多肽時(shí)，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體,，多肽合成時(shí)應(yīng)將不需要反應(yīng)的基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來,，方可進(jìn)行成肽反應(yīng)，這樣保證了多肽合成目標(biāo)產(chǎn)物的定向性,。多肽的化學(xué)合成又分為液相合成和固相合成,。
多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡(jiǎn)潔迅速,，可用于各種生物活性多肽片段的合成,。片段組合法主要包括天然化學(xué)連接和施陶丁格連接。近年,，多肽液相片段合成法發(fā)展迅速,，在多肽和蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中,，根據(jù)多肽片段的化學(xué)特定性或化學(xué)選擇性,，多肽片段能夠自發(fā)進(jìn)行連接，得到目標(biāo)多肽,。因?yàn)槎嚯钠魏械陌被釟埢鄬?duì)較少,，所以純度較高，且易于純化,。
多肽的生物合成方法主要包括發(fā)酵法,、酶解法,，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展,，以DNA重組技術(shù)為主導(dǎo)的基因工程法也被應(yīng)用于多肽的合成。
多肽的固相合成
多肽的合成是氨基酸重復(fù)添加的過程,，通常從C端向N端(氨基端)進(jìn)行合成,。多肽固相合成的原理是將目的肽的第一個(gè)氨基酸C端通過共價(jià)鍵與固相載體連接，再以該氨基酸N端為合成起點(diǎn),，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基和過量的已活化的第二個(gè)氨基酸進(jìn)行反應(yīng),，接長(zhǎng)肽鏈，重復(fù)操作,，達(dá)到理想的合成肽鏈長(zhǎng)度,，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，分離純化,，獲得目標(biāo)多肽,。
1、Boc多肽合成法
Boc方法是經(jīng)典的多肽固相合成法，以Boc作為氨基酸α-氨基的保護(hù)基,，芐醇類作為側(cè)鏈保護(hù)基,，Boc的脫除通常采用三(TFA)進(jìn)行。多肽合成時(shí)將已用Boc保護(hù)好的N-α-氨基酸共價(jià)交聯(lián)到樹脂上,，TFA切除Boc保護(hù)基,，N端用弱堿中和。
肽鏈的延長(zhǎng)通過二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)活化,、偶聯(lián)進(jìn)行,，最終采用強(qiáng)酸氫氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標(biāo)多肽從樹脂上解離。在Boc多肽合成法中,，為了便于下一步的多肽合成,，反復(fù)用酸進(jìn)行脫保護(hù)，一些副反應(yīng)被帶入實(shí)驗(yàn)中,，例如多肽容易從樹脂上切除下來,，氨基酸側(cè)鏈在酸性條件不穩(wěn)定等。
2,、Fmoc多肽合成法
Carpino和Han以Boc多肽合成法為基礎(chǔ)發(fā)展起來一種多肽固相合成的新方法——Fmoc多肽合成法,。
Fmoc多肽合成法以Fmoc作為氨基酸α-氨基的保護(hù)基。其優(yōu)勢(shì)為在酸性條件下是穩(wěn)定的,，不受TFA等試劑的影響,，應(yīng)用溫和的堿處理可脫保護(hù)，所以側(cè)鏈可用易于酸脫除的Boc保護(hù)基進(jìn)行保護(hù),。
肽段的最后切除可采用TFA/二氯甲烷(DCM)從樹脂上定量完成,，避免了采用強(qiáng)酸。同時(shí),，與Boc法相比,，F(xiàn)moc法反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少,，產(chǎn)率高,，并且Fmoc基團(tuán)本身具有特征性紫外吸收，易于監(jiān)測(cè)控制反應(yīng)的進(jìn)行,。Fmoc法在多肽固相合成領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛,。
多肽液相分段合成
隨著多肽合成的發(fā)展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依據(jù)其化學(xué)專一性或化學(xué)選擇性,，自發(fā)連接成長(zhǎng)肽的合成方法)在多肽合成領(lǐng)域中的作用越來越突出,。其特點(diǎn)在于可以用于長(zhǎng)肽的合成，并且純度高,，易于純化,。
多肽液相分段合成主要分為天然化學(xué)連接和施陶丁格連接,。天然化學(xué)連接是多肽分段合成的基礎(chǔ)方法，局限在于所合成的多肽必須含半光氨酸(Cys)殘基,，因而限定了天然化學(xué)連接方法的應(yīng)用范圍,。天然化學(xué)連接方法的延伸包括化學(xué)區(qū)域選擇連接、可除去輔助基連接,、光敏感輔助基連接,。
施陶丁格連接方法是另一種基礎(chǔ)的片段連接方法，其為多肽片段連接途徑開拓了更廣闊的思路,。正交化學(xué)連接方法是施陶丁格連接方法的延伸,，通過簡(jiǎn)化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率。
其他多肽合成方法
1,、氨基酸的羧內(nèi)酸酐法(NCA)
氨基酸的羧內(nèi)酸酐的氨基保護(hù)基也可活化羧基,。
NCA的原理:在堿性條件下,，氨基酸陰離子與NCA形成一個(gè)更穩(wěn)定的氨基甲酸酯類離子,，在酸化時(shí)該離子失去二氧化碳，生成二肽,。生成的二肽又與其他的NCA結(jié)合,，反復(fù)進(jìn)行,。
NCA適用于短鏈肽片段的多肽合成，其周期短,、操作簡(jiǎn)單,、成本低、得到產(chǎn)物分子量高,，在目前多肽合成中所占比例較大,，技術(shù)也較為通用。
2,、組合化學(xué)法20世紀(jì)80年代,，以固相多肽合成為基礎(chǔ)提出了組合化學(xué)法，即氨基酸的構(gòu)建單元通過組合的方式進(jìn)行連接,，合成出含有大量化合物的化學(xué)庫(kù),，并從中篩選出具有某種理化性質(zhì)或藥理活性化合物的一套多肽合成策略和篩選方案,。
組合化學(xué)法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法,、迭代法、光控定位組合庫(kù)法,、茶葉袋法等,。組合化學(xué)法的在于可同時(shí)合成多種化合物，并且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構(gòu)體,。
3,、酶解法是用生物酶降解植物蛋白質(zhì)和動(dòng)物蛋白質(zhì)，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產(chǎn)量低,、投資大,、周期長(zhǎng)、污染嚴(yán)重,，未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質(zhì)原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且可以獲得比原蛋白質(zhì)更多的功能,，更加綠色,，更加健康。
4,、基因工程法主要以DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ),，通過合適的DNA模板來控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了準(zhǔn)彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG),。
利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的活性多肽還有肽類抗生素,、干擾素類、白介素類,、生長(zhǎng)因子類,、腫瘤壞死因子、人生長(zhǎng)激素,，血液中凝血因子,、促紅細(xì)胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等,。
基因工程法合成多肽具有表達(dá)定向性強(qiáng),，安全衛(wèi)生，原料來源廣泛和成本低等優(yōu)點(diǎn),，但因存在高效表達(dá),，不易分離，產(chǎn)率低的問題,，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
5,、發(fā)酵法是從微生物代謝產(chǎn)物中獲得多肽的方法,。雖然發(fā)酵法的成本低，但其應(yīng)用范圍較窄,，因?yàn)楝F(xiàn)在微生物能夠獨(dú)立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL),、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍(lán)細(xì)菌肽。