分光光度計的應(yīng)用常識
分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器,。常用于核酸,,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量,。
分光光度計的簡單原理
分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,,光源透過測試的樣品后,,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率高的功能,??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈,、雙鏈DNA,,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長 260 nm,。 每種核酸的分子構(gòu)成不一,,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,,40μg/ml的RNA,,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,,從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測試前,選擇正確的程序,,輸入原液和稀釋液的體積,,爾后測試空白液和樣品液。然而,,實驗并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實上,分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如準(zhǔn)確度≤1.0%(1A),。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,,都是正常的,。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,,離子濃度等:在測試時,,離子濃度太高,也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,,因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,如TE,,可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了盡可能減少顆粒對測試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,,吸光值盡量在0.1-1.,。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,,結(jié)果穩(wěn)定,。
分光光度計的簡單原理
分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,,光源透過測試的樣品后,,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率高的功能,??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈,、雙鏈DNA,,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長 260 nm,。 每種核酸的分子構(gòu)成不一,,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,,40μg/ml的RNA,,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,,從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測試前,選擇正確的程序,,輸入原液和稀釋液的體積,,爾后測試空白液和樣品液。然而,,實驗并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實上,分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如準(zhǔn)確度≤1.0%(1A),。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,,都是正常的,。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,,離子濃度等:在測試時,,離子濃度太高,也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,,因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,如TE,,可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了盡可能減少顆粒對測試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,,吸光值盡量在0.1-1.,。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,,結(jié)果穩(wěn)定,。