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分光光度計(jì)的應(yīng)用常識(shí)
分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器,。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量,。
分光光度計(jì)的簡(jiǎn)單原理
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源,，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后,，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值,，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長(zhǎng) 260 nm,。 每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù),。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測(cè)試前，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如準(zhǔn)確度≤1.0%(1A),。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),，都是正常的。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高,，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了盡可能減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值盡量在0.1-1.。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對(duì)較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。
分光光度計(jì)的簡(jiǎn)單原理
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源,，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后,，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值,，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長(zhǎng) 260 nm,。 每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù),。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測(cè)試前，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如準(zhǔn)確度≤1.0%(1A),。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),，都是正常的。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高,，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了盡可能減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值盡量在0.1-1.。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對(duì)較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。