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近紅外光譜法在藥物分析中的應(yīng)用
近年來,，由于巨型計算機與化學(xué)統(tǒng)計學(xué)軟件的發(fā)展,，特別是化學(xué)計量學(xué)的深入研究和廣泛應(yīng)用，使其成為發(fā)展zui快,、zui引人注目的光譜技術(shù),。而且由于該技術(shù)方便快速，無需對樣品進(jìn)行預(yù)處理,，適用于在線分析等特點，在藥物分析領(lǐng)域中正不斷得到重視與應(yīng)用,。
近紅外(NearInfrared,，NIR)光譜的波長范圍是780~2526nm(12820~3959cm-1)，通常又將此波長范圍劃分為近紅外短波區(qū)(780~1100nm)和近紅外長波區(qū)(1100~2526nm),。由于該區(qū)域主要是O-H,，N-H，C-H,，S-H等含氫基團(tuán)振動光譜的倍頻及合頻吸收,，譜帶寬，重疊較嚴(yán)重,，而且吸收信號弱,，信息解析復(fù)雜,，所以雖然該譜區(qū)發(fā)現(xiàn)較早，但分析價值一直未能得到足夠的重視,。
1近紅外光譜的測量
根據(jù)NIR光譜的獲得方式,，通常有透射(Transmittance)和漫反射(DiffuseReflectance)兩種[2]。
透射測定法的定量關(guān)系遵從Lambert-Beer定律,，主要適用于液體樣品,，其正常的工作波長范圍是850~1050nm[3]。浙江大學(xué)的史月華等人用該原理,，在93%~97.4%的濃度范圍內(nèi)利用維生素E在6061~5246cm-1處的近紅外吸收峰面積積分值和其濃度關(guān)系建立回歸方程,，對已知濃度的樣品進(jìn)行預(yù)測，誤差及相對誤差均在0.79%~0.9%內(nèi)[4,，5],。
漫反射測定法是對固體樣品進(jìn)行近紅外測定常用的方法。當(dāng)光源垂直于樣品的表面,，有一部分漫反射光會向各個方向散射,，將檢測器放在與垂直光成45o角的位置測定散射光強的方法稱為漫反射法。漫反射光強度A與反射率R的關(guān)系為式中,，R1為反射光強,，R0為*不吸收的表面反射光強。國內(nèi)已有人先后用漫反射技術(shù)測定了精氨酸阿司匹林[6],、安乃近[7],、蘆丁和維生素E[8]等的含量，并且用反射光譜法對磺胺噻唑[9]進(jìn)行質(zhì)量評價,。
以透射和漫反射為測試基礎(chǔ),，為適應(yīng)不同物質(zhì)在不同狀態(tài)時直接測定其近紅外光譜，90年代以來光纖技術(shù)在NIR中得到了廣泛應(yīng)用,。光纖不僅可方便的傳輸光譜信號,，各式各樣的光纖探頭還極大地方便了NIR進(jìn)行各類快速在線分析。
2近紅外光譜技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用
2.1應(yīng)用范圍
近紅外光譜法在藥物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛,，它不僅適用于藥物的多種不同狀態(tài)如原料[10],、完整的片劑、膠囊與液體等制劑[11],，還可用于不同類型的藥品,，如蛋白質(zhì)[12]、中草藥[13],、抗生素[14]等藥物的分析,。NIR更適用于對原料藥純度、包裝材料等的分析與檢測以及生產(chǎn)工藝的監(jiān)控[15，16];利用不同的光纖探頭可實現(xiàn)生產(chǎn)工藝的在線連續(xù)分析監(jiān)控[17,，18,，19，20,，21],。
2.2定性、定量分析
現(xiàn)代近紅外光譜技術(shù)不是通過觀察供試品譜圖特征或測量供試品譜圖參數(shù)直接進(jìn)行定性或定量分析,，而是首先通過測定樣品校正集的光譜,、組成或性質(zhì)數(shù)據(jù)(組成或性質(zhì)數(shù)據(jù)需通過其它認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法測定)，采用合適的化學(xué)計量學(xué)方法建立校正模型,，再通過建立的校正模型與未知樣品進(jìn)行比較,，實現(xiàn)定性或定量分析。
2.2.1定性分析
近紅外光譜譜帶較寬,，特征性不強,，因此很少像其它光譜(如紫外光譜和紅外光譜)那樣用于化合物基團(tuán)的識別及結(jié)構(gòu)的鑒定。近紅外光譜的定性分析一般是用于確定分析樣品在已知樣品集中的位置[22],。常用的方法包括:
(1)判別分析法：判別分析是經(jīng)典的定性識別方法,，其基本思路是相同樣品在不同波長下具有相近的光譜吸收，這種光譜間的比較可以是原始光譜,，也可以是經(jīng)過處理的光譜,。
(2)主成分分析(PrincipalComponentAnalysisPCA)法：利用PCA方法將多波長下的光譜數(shù)據(jù)壓縮到有限的幾個因子空間內(nèi)，再通過樣品在各因子空間的得分確定其歸屬類別,，但PCA對樣本與校正集間的確切位置缺乏定量的解釋,。任玉林等采用此方法研究了去痛片[23]的近紅外漫反射光譜，總結(jié)出對標(biāo)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析可減小顆粒大小的變化所產(chǎn)生的散射影響,，并且用第二主成分得分對*主成分作圖可以將合格樣品與不合格樣品區(qū)分開來,。其缺點是當(dāng)真藥與劣藥的含量相當(dāng)接近時此法容易分錯[24]。
(3)馬氏距離(MahalanobisDistanceMD)法：該方法的核心是通過多波長下的光譜距離定量描述出測量樣本離校正集樣本的位置,，因而在光譜匹配異常點檢測和模型外推方面都很有用,。但應(yīng)用該方法時，波長位置的選擇非常重要,，波長點過少,，光譜得不到合理的描述;波長點過多，計算量大,，為此,，徐廣通提出將PCA與馬氏距離相結(jié)合解決模型的適用性判斷,，可以充分利用PCA對大量光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理,，也較好地解決了馬氏距離計算時波長點的選擇問題，避免了大量光譜數(shù)據(jù)直接進(jìn)行馬氏距離計算出現(xiàn)的共線性或計算量大等問題，且克服了采用PCA自身進(jìn)行判斷界限不易量化的問題[25],。
2.2.2定量分析
近紅外光譜測量時一般不需對樣品進(jìn)行預(yù)處理,，但測定的光譜可能受到各種干擾因素的影響,。利用單一波長下獲得的光譜數(shù)據(jù)很難獲得準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果,。NIR光譜結(jié)構(gòu)復(fù)雜,，譜圖重疊較多,，所以在進(jìn)行定量分析時,，一般采用多波長下獲得的數(shù)據(jù)并進(jìn)行一定的數(shù)據(jù)處理才能獲得準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果。常用方法如下：
(1)主成分回歸(PrincipalComponentRegression,，PCR)：原理與PCA相同,。吉林大學(xué)的任玉林等在此方面進(jìn)行了深入研究[26]。PCR在解釋光譜數(shù)據(jù)時起著重要作用,，從主成分權(quán)重圖中能夠確定主成分與哪個組份有關(guān),，但確切而全面地解釋每個主成分代表什么迄今仍是zui難解決的問題,。
(2)偏zui小二乘法(PartialLeastSquarePLS)：該法是一種全光譜分析方法，充分利用多個波長下的有用信息,，無需刻意的選擇波長，并能濾去原始數(shù)據(jù)噪音,，提高信噪比,，解決交互影響的非線性問題,，很合適在NIR中使用[27],。實驗證明，PLS法同近紅外漫反射光譜法結(jié)合,，直接分析固態(tài)粉末藥品磺胺甲基異唑[28]、安體舒通[29],、安乃近[30]、磺胺脒[31]是可行的,，同其它方法相比具有速度快,、簡便、且不破壞樣品的優(yōu)點,。
(3)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(ArtificialNeuralNetworksANN)：近年來興起的ANN法研究,，根據(jù)樣品各組分的光譜數(shù)據(jù)建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,，預(yù)測未知樣品并討論影響網(wǎng)絡(luò)的各參數(shù)。采用ANN法對阿司匹林[32],、撲熱息痛[33],、美的康[34]等藥物定量分析的結(jié)果表明，ANN法的zui大優(yōu)點是其抗干擾、抗噪音及強大的非線性轉(zhuǎn)換能力,，對于某些特殊情況ANN會得到更小的校正誤差和預(yù)測誤差,，并且它的預(yù)示結(jié)果要稍優(yōu)于PLS(t檢驗無顯著差異),。這可能是由于ANN法具有更強的非線性處理能力所致,。
此外還有多元線性回歸(MultipleLinearRegressionMLR)、拓?fù)?TopologyTP)等方法也在近紅外光譜分析中得到應(yīng)用,。
3問題與展望
盡管NIR在藥物分析領(lǐng)域顯現(xiàn)出勃勃生機,，但目前它還存在一定的弱點,。首先,，它是一種間接的相對分析技術(shù)，通過收集大量具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)樣品,，通過嚴(yán)格細(xì)致的化學(xué)分析測出必要的數(shù)據(jù),，再通過計算機建立數(shù)學(xué)模型，預(yù)測未知樣品的結(jié)果,。而模型的建立需耗用大量的人力,、物力和財力;其次，由于NIR譜區(qū)為分子倍頻與合頻的振動光譜,，信號弱,，譜峰重疊嚴(yán)重,，所以目前還僅能用于常量分析,，被測定組分的量一般應(yīng)大于樣品重量的0.1%;此外,，在進(jìn)行近紅外光譜分析時,，應(yīng)考慮樣品的特征,、分析實驗的設(shè)計及數(shù)據(jù)處理等多方面的問題，才能取得正確的分析結(jié)果,，建立可靠的校正模型是近紅外光譜成功的關(guān)鍵,，而合理的實驗設(shè)計和恰當(dāng)?shù)姆治瞿Ｐ蛣t是建立校正模型的關(guān)鍵[35]。
NIR光譜分析的zui大特點是操作簡便,、快速,，可不破壞樣品進(jìn)行原位、在線測量;測量信號又可以遠(yuǎn)距離傳輸和分析;特別是與計算機技術(shù)和光導(dǎo)纖維技術(shù)相結(jié)合,，采用NIR透射,、散射,、漫反射光譜學(xué)檢測方法,，可以不使用化學(xué)試劑,，不必進(jìn)行預(yù)處理，可直接對顆粒狀,、固體狀,、糊狀、不透明的樣品進(jìn)行分析,。這些特點正逐漸被制藥界所認(rèn)識,，并顯示出極大潛力，在制藥工作和質(zhì)量控制分析中具有廣闊的應(yīng)用前景,。此外,，NIR用于生產(chǎn)過程中的含量與水分分析也表現(xiàn)出*的魅力[36]。目前NIR已成為AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)一種標(biāo)準(zhǔn)分析方法應(yīng)用于藥品檢測中[37],。儀器生產(chǎn)商和藥物分析專家的合作開發(fā)已使FDA、歐洲和加拿大藥物管理局正式研究用近紅外光譜分析技術(shù)取代繁瑣費時的常規(guī)分析方法的可行性,，部分測試項目已被FDA批準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)方法。USP(UnitedStatesPharmacopia第25版)zui近已在附錄中增補近紅外分析方法[38],。
國內(nèi),，在SDA(StateDrugAdministration)的支持下，我所正在探索藥品監(jiān)督檢驗執(zhí)法過程中采用NIR進(jìn)行快速鑒別及定量分析的可行性,。結(jié)合全國抽驗工作,，對NIR模型的準(zhǔn)確性及模型傳遞的誤差進(jìn)行系統(tǒng)評價,，這項工作的開展對打擊假劣藥品具有重要意義,。
近紅外(NearInfrared,，NIR)光譜的波長范圍是780~2526nm(12820~3959cm-1)，通常又將此波長范圍劃分為近紅外短波區(qū)(780~1100nm)和近紅外長波區(qū)(1100~2526nm),。由于該區(qū)域主要是O-H,，N-H，C-H,，S-H等含氫基團(tuán)振動光譜的倍頻及合頻吸收,，譜帶寬，重疊較嚴(yán)重,，而且吸收信號弱,，信息解析復(fù)雜,，所以雖然該譜區(qū)發(fā)現(xiàn)較早，但分析價值一直未能得到足夠的重視,。
1近紅外光譜的測量
根據(jù)NIR光譜的獲得方式,，通常有透射(Transmittance)和漫反射(DiffuseReflectance)兩種[2]。
透射測定法的定量關(guān)系遵從Lambert-Beer定律,，主要適用于液體樣品,，其正常的工作波長范圍是850~1050nm[3]。浙江大學(xué)的史月華等人用該原理,，在93%~97.4%的濃度范圍內(nèi)利用維生素E在6061~5246cm-1處的近紅外吸收峰面積積分值和其濃度關(guān)系建立回歸方程,，對已知濃度的樣品進(jìn)行預(yù)測，誤差及相對誤差均在0.79%~0.9%內(nèi)[4,，5],。
漫反射測定法是對固體樣品進(jìn)行近紅外測定常用的方法。當(dāng)光源垂直于樣品的表面,，有一部分漫反射光會向各個方向散射,，將檢測器放在與垂直光成45o角的位置測定散射光強的方法稱為漫反射法。漫反射光強度A與反射率R的關(guān)系為式中,，R1為反射光強,，R0為*不吸收的表面反射光強。國內(nèi)已有人先后用漫反射技術(shù)測定了精氨酸阿司匹林[6],、安乃近[7],、蘆丁和維生素E[8]等的含量，并且用反射光譜法對磺胺噻唑[9]進(jìn)行質(zhì)量評價,。
以透射和漫反射為測試基礎(chǔ),，為適應(yīng)不同物質(zhì)在不同狀態(tài)時直接測定其近紅外光譜，90年代以來光纖技術(shù)在NIR中得到了廣泛應(yīng)用,。光纖不僅可方便的傳輸光譜信號,，各式各樣的光纖探頭還極大地方便了NIR進(jìn)行各類快速在線分析。
2近紅外光譜技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用
2.1應(yīng)用范圍
近紅外光譜法在藥物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛,，它不僅適用于藥物的多種不同狀態(tài)如原料[10],、完整的片劑、膠囊與液體等制劑[11],，還可用于不同類型的藥品,，如蛋白質(zhì)[12]、中草藥[13],、抗生素[14]等藥物的分析,。NIR更適用于對原料藥純度、包裝材料等的分析與檢測以及生產(chǎn)工藝的監(jiān)控[15，16];利用不同的光纖探頭可實現(xiàn)生產(chǎn)工藝的在線連續(xù)分析監(jiān)控[17,，18,，19，20,，21],。
2.2定性、定量分析
現(xiàn)代近紅外光譜技術(shù)不是通過觀察供試品譜圖特征或測量供試品譜圖參數(shù)直接進(jìn)行定性或定量分析,，而是首先通過測定樣品校正集的光譜,、組成或性質(zhì)數(shù)據(jù)(組成或性質(zhì)數(shù)據(jù)需通過其它認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法測定)，采用合適的化學(xué)計量學(xué)方法建立校正模型,，再通過建立的校正模型與未知樣品進(jìn)行比較,，實現(xiàn)定性或定量分析。
2.2.1定性分析
近紅外光譜譜帶較寬,，特征性不強,，因此很少像其它光譜(如紫外光譜和紅外光譜)那樣用于化合物基團(tuán)的識別及結(jié)構(gòu)的鑒定。近紅外光譜的定性分析一般是用于確定分析樣品在已知樣品集中的位置[22],。常用的方法包括:
(1)判別分析法：判別分析是經(jīng)典的定性識別方法,，其基本思路是相同樣品在不同波長下具有相近的光譜吸收，這種光譜間的比較可以是原始光譜,，也可以是經(jīng)過處理的光譜,。
(2)主成分分析(PrincipalComponentAnalysisPCA)法：利用PCA方法將多波長下的光譜數(shù)據(jù)壓縮到有限的幾個因子空間內(nèi)，再通過樣品在各因子空間的得分確定其歸屬類別,，但PCA對樣本與校正集間的確切位置缺乏定量的解釋,。任玉林等采用此方法研究了去痛片[23]的近紅外漫反射光譜，總結(jié)出對標(biāo)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析可減小顆粒大小的變化所產(chǎn)生的散射影響,，并且用第二主成分得分對*主成分作圖可以將合格樣品與不合格樣品區(qū)分開來,。其缺點是當(dāng)真藥與劣藥的含量相當(dāng)接近時此法容易分錯[24]。
(3)馬氏距離(MahalanobisDistanceMD)法：該方法的核心是通過多波長下的光譜距離定量描述出測量樣本離校正集樣本的位置,，因而在光譜匹配異常點檢測和模型外推方面都很有用,。但應(yīng)用該方法時，波長位置的選擇非常重要,，波長點過少,，光譜得不到合理的描述;波長點過多，計算量大,，為此,，徐廣通提出將PCA與馬氏距離相結(jié)合解決模型的適用性判斷,，可以充分利用PCA對大量光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理,，也較好地解決了馬氏距離計算時波長點的選擇問題，避免了大量光譜數(shù)據(jù)直接進(jìn)行馬氏距離計算出現(xiàn)的共線性或計算量大等問題，且克服了采用PCA自身進(jìn)行判斷界限不易量化的問題[25],。
2.2.2定量分析
近紅外光譜測量時一般不需對樣品進(jìn)行預(yù)處理,，但測定的光譜可能受到各種干擾因素的影響,。利用單一波長下獲得的光譜數(shù)據(jù)很難獲得準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果,。NIR光譜結(jié)構(gòu)復(fù)雜,，譜圖重疊較多,，所以在進(jìn)行定量分析時,，一般采用多波長下獲得的數(shù)據(jù)并進(jìn)行一定的數(shù)據(jù)處理才能獲得準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果。常用方法如下：
(1)主成分回歸(PrincipalComponentRegression,，PCR)：原理與PCA相同,。吉林大學(xué)的任玉林等在此方面進(jìn)行了深入研究[26]。PCR在解釋光譜數(shù)據(jù)時起著重要作用,，從主成分權(quán)重圖中能夠確定主成分與哪個組份有關(guān),，但確切而全面地解釋每個主成分代表什么迄今仍是zui難解決的問題,。
(2)偏zui小二乘法(PartialLeastSquarePLS)：該法是一種全光譜分析方法，充分利用多個波長下的有用信息,，無需刻意的選擇波長，并能濾去原始數(shù)據(jù)噪音,，提高信噪比,，解決交互影響的非線性問題,，很合適在NIR中使用[27],。實驗證明，PLS法同近紅外漫反射光譜法結(jié)合,，直接分析固態(tài)粉末藥品磺胺甲基異唑[28]、安體舒通[29],、安乃近[30]、磺胺脒[31]是可行的,，同其它方法相比具有速度快,、簡便、且不破壞樣品的優(yōu)點,。
(3)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(ArtificialNeuralNetworksANN)：近年來興起的ANN法研究,，根據(jù)樣品各組分的光譜數(shù)據(jù)建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,，預(yù)測未知樣品并討論影響網(wǎng)絡(luò)的各參數(shù)。采用ANN法對阿司匹林[32],、撲熱息痛[33],、美的康[34]等藥物定量分析的結(jié)果表明，ANN法的zui大優(yōu)點是其抗干擾、抗噪音及強大的非線性轉(zhuǎn)換能力,，對于某些特殊情況ANN會得到更小的校正誤差和預(yù)測誤差,，并且它的預(yù)示結(jié)果要稍優(yōu)于PLS(t檢驗無顯著差異),。這可能是由于ANN法具有更強的非線性處理能力所致,。
此外還有多元線性回歸(MultipleLinearRegressionMLR)、拓?fù)?TopologyTP)等方法也在近紅外光譜分析中得到應(yīng)用,。
3問題與展望
盡管NIR在藥物分析領(lǐng)域顯現(xiàn)出勃勃生機,，但目前它還存在一定的弱點,。首先,，它是一種間接的相對分析技術(shù)，通過收集大量具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)樣品,，通過嚴(yán)格細(xì)致的化學(xué)分析測出必要的數(shù)據(jù),，再通過計算機建立數(shù)學(xué)模型，預(yù)測未知樣品的結(jié)果,。而模型的建立需耗用大量的人力,、物力和財力;其次，由于NIR譜區(qū)為分子倍頻與合頻的振動光譜,，信號弱,，譜峰重疊嚴(yán)重,，所以目前還僅能用于常量分析,，被測定組分的量一般應(yīng)大于樣品重量的0.1%;此外,，在進(jìn)行近紅外光譜分析時,，應(yīng)考慮樣品的特征,、分析實驗的設(shè)計及數(shù)據(jù)處理等多方面的問題，才能取得正確的分析結(jié)果,，建立可靠的校正模型是近紅外光譜成功的關(guān)鍵,，而合理的實驗設(shè)計和恰當(dāng)?shù)姆治瞿Ｐ蛣t是建立校正模型的關(guān)鍵[35]。
NIR光譜分析的zui大特點是操作簡便,、快速,，可不破壞樣品進(jìn)行原位、在線測量;測量信號又可以遠(yuǎn)距離傳輸和分析;特別是與計算機技術(shù)和光導(dǎo)纖維技術(shù)相結(jié)合,，采用NIR透射,、散射,、漫反射光譜學(xué)檢測方法,，可以不使用化學(xué)試劑,，不必進(jìn)行預(yù)處理，可直接對顆粒狀,、固體狀,、糊狀、不透明的樣品進(jìn)行分析,。這些特點正逐漸被制藥界所認(rèn)識,，并顯示出極大潛力，在制藥工作和質(zhì)量控制分析中具有廣闊的應(yīng)用前景,。此外,，NIR用于生產(chǎn)過程中的含量與水分分析也表現(xiàn)出*的魅力[36]。目前NIR已成為AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)一種標(biāo)準(zhǔn)分析方法應(yīng)用于藥品檢測中[37],。儀器生產(chǎn)商和藥物分析專家的合作開發(fā)已使FDA、歐洲和加拿大藥物管理局正式研究用近紅外光譜分析技術(shù)取代繁瑣費時的常規(guī)分析方法的可行性,，部分測試項目已被FDA批準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)方法。USP(UnitedStatesPharmacopia第25版)zui近已在附錄中增補近紅外分析方法[38],。
國內(nèi),，在SDA(StateDrugAdministration)的支持下，我所正在探索藥品監(jiān)督檢驗執(zhí)法過程中采用NIR進(jìn)行快速鑒別及定量分析的可行性,。結(jié)合全國抽驗工作,，對NIR模型的準(zhǔn)確性及模型傳遞的誤差進(jìn)行系統(tǒng)評價,，這項工作的開展對打擊假劣藥品具有重要意義,。