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產(chǎn)品簡介
詳細介紹
美國ABI 310基因測序儀
DNA序列測定分手工測序和自動測序,，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法,。自動化測序?qū)嶋H上已成為當今DNA序列分析的主流,。美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型,、377型、310型,、3700和3100型等DNA測序儀,，其中310型是臨床檢測實驗室中使用多的一種型號。
美國ABI 310基因測序儀 【原理】
ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀),，采用毛細管電泳技術取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳,，應用該公司的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物,，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內(nèi)電泳,，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的度,。由于分子大小不同,，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數(shù)窗口段時,，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測,，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,，并在CCD攝影機上同步成像,，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的,。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜,、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠,、自動進樣,、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物,，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4),。這些凝膠顆粒孔徑均一,，避免了配膠條件不*對測序精度的影響,。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦,、彩色打印機和電泳等附件組成,。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件,。它使用CCD攝影機檢測器,，使DNA測序縮短2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min,。
由于該儀器具有DNA測序,，PCR片段大小分析和定量分析等功能,，因此可進行DNA測序,、雜合子分析、單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP),、微衛(wèi)星序列分析,、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外,，還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析,、基因突變檢測、HLA配型,、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定,、微生物與病毒的分型與鑒定等。
美國ABI 310基因測序儀 【試劑與器材】
1．BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix,，內(nèi)含PE四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP,，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等,。
2．pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2g/L,，試劑盒配套試劑。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,，3.2μmol/L,，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑,。
4．DNA測序模板 可以是PCR產(chǎn)物,、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應調(diào)整在PCR反應時取量1μl為宜,。本實驗測定的質(zhì)粒DNA,，濃度為0.2g/L，即200ng/μl,。
5．引物 需根據(jù)所要測定的DNA片段設計正向或反向引物,，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl,。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物,，如M13(-21)引物，T7引物等,。
6．滅菌去離子水或三蒸水,。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離，PE公司產(chǎn)品,。
8．3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc•3H2O溶于70ml蒸餾水中,，冰醋酸調(diào)pH5.2，定容100ml,，高壓滅菌后分裝,。
9．70%乙醇和無水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻,，室溫可保存1年,。
11．POP 6測序膠 ABI產(chǎn)品,。
12．模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品。
13．10×電泳緩沖液 ABI產(chǎn)品,。
14．ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀,。
15．2400型或9600型PCR儀。
16．臺式冷凍高速離心機,。
17．臺式高速離心機或袖珍離心機,。
【操作步驟】
1．PCR測序反應
(1) 取0.2ml的PCR管,，用記號筆編號,，將管插在顆粒冰中,，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標準對照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待測的質(zhì)粒DNA 1μl －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1μl
待測DNA的正向引物 1μl －
M13(-21)引物 － 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油,，蓋緊PCR管,，用手指彈管混勻，稍離心,。
(2) 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增,。98℃變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10s,，50℃ 5s,，60℃4min，25個循環(huán),，擴增結(jié)束后設置4℃保溫,。
2．醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
(1) 將混合物離心，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中,。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液,，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA,。12 000r/min于4℃離心30 min,，小心棄上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉淀2次,。12 000r/min于4℃離心5min,，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min,。
3．電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理,。
(1) 加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩,，讓其充分溶解DNA沉淀,，稍離心。
(2) 將溶液轉(zhuǎn)移蓋體分離的0.2ml PCR管中,，稍離心,。
(3) 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2min),，冰中驟冷,，待上機,。
4．上機操作 按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正,，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件,。儀器將自動灌膠毛細管，1.2kV預電泳5min,，按編程次序自動進樣,，再預電泳(1.2kV，20min),，在7.5kV下電泳2h,。電泳結(jié)束后儀器會自動清洗，灌膠,，進下一樣品,，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h,。電泳結(jié)束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜,。
5．儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較,。如測序序列已知,，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率,。
6．測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng),。
【計算】
測序反應度計算公式：*－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650×*差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基,。
【注意事項與評價】
1．ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器,，需專人操作、管理和維護,。
2．本實驗測序PCR反應的總體積是5μl,，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要,，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外,，選用PE公司的PCR管。如PCR結(jié)束后PCR液小于4～4.5μl,，則此PCR反應可能失敗,，不必進行純化和上樣。
3．作為測序用戶來說,，只需提供純化好的DNA樣品和引物,，一個測序PCR反應使用的模板不同,，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少,，一般PCR產(chǎn)物需30～90ng,，單鏈DNA需50～100ng，雙鏈DNA需200～500ng,，DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6～2.0,，用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解,。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好,。
4．本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測DNA長度為650bp左右,。本儀器DNA測序度為(98.5±0.5) %,，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測定的長度超過了650bp,，則需設計另外的引物,。為保證測序更為準確，可設計反向引物對同一模板進行測序,，相互印證,。對于N堿基可進行人工核對，有時可以辨讀出來,。為提高測序的度,，根據(jù)星號提示位置，可人工分析該處彩色圖譜,，對該處堿基作進一步核對