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美國(guó)ABI 310基因測(cè)序儀
DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序,，手工測(cè)序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法,。自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流,。美國(guó)PE ABI公司已生產(chǎn)出373型,、377型、310型,、3700和3100型等DNA測(cè)序儀,，其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中使用多的一種型號(hào)。
美國(guó)ABI 310基因測(cè)序儀 【原理】
ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測(cè)序儀),，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳,，應(yīng)用該公司的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過(guò)單引物PCR測(cè)序反應(yīng),，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物,，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響,，大大提高了測(cè)序的度,。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同,，當(dāng)其通過(guò)毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí),，激光檢測(cè)器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,，并在CCD攝影機(jī)上同步成像,，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的,。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜,、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺(tái)能自動(dòng)灌膠,、自動(dòng)進(jìn)樣,、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測(cè)定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物,，包括DNA測(cè)序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4),。這些凝膠顆粒孔徑均一,，避免了配膠條件不*對(duì)測(cè)序精度的影響,。它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦,、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成,。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運(yùn)行等軟件,。它使用CCD攝影機(jī)檢測(cè)器,，使DNA測(cè)序縮短2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min,。
由于該儀器具有DNA測(cè)序,，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測(cè)序,、雜合子分析,、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析,、長(zhǎng)片段PCR,、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測(cè)序外,，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析,、基因突變檢測(cè)、HLA配型,、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定,、微生物與病毒的分型與鑒定等。
美國(guó)ABI 310基因測(cè)序儀 【試劑與器材】
1．BigDye測(cè)序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix,，內(nèi)含PE四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP,，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。
2．pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對(duì)照模板 0.2g/L,，試劑盒配套試劑,。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L,，即3.2pmol/μl,，試劑盒配套試劑。
4．DNA測(cè)序模板 可以是PCR產(chǎn)物,、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等,。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1μl為宜,。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)粒DNA,，濃度為0.2g/L，即200ng/μl,。
5．引物 需根據(jù)所要測(cè)定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物,，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl,。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物,，如M13(-21)引物，T7引物等,。
6．滅菌去離子水或三蒸水,。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離，PE公司產(chǎn)品,。
8．3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱(chēng)取40.8g NaAc•3H2O溶于70ml蒸餾水中,，冰醋酸調(diào)pH5.2，定容100ml,，高壓滅菌后分裝,。
9．70%乙醇和無(wú)水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無(wú)水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻,，室溫可保存1年,。
11．POP 6測(cè)序膠 ABI產(chǎn)品。
12．模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品,。
13．10×電泳緩沖液 ABI產(chǎn)品,。
14．ABI PRISM 310型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀。
15．2400型或9600型PCR儀,。
16．臺(tái)式冷凍高速離心機(jī),。
17．臺(tái)式高速離心機(jī)或袖珍離心機(jī)。
【操作步驟】
1．PCR測(cè)序反應(yīng)
(1) 取0.2ml的PCR管,，用記號(hào)筆編號(hào),，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測(cè)定模板管 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待測(cè)的質(zhì)粒DNA 1μl －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1μl
待測(cè)DNA的正向引物 1μl －
M13(-21)引物 － 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油,，蓋緊PCR管,，用手指彈管混勻，稍離心,。
(2) 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,。98℃變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10s,，50℃ 5s,，60℃4min，25個(gè)循環(huán),，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫,。
2．醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
(1) 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中,。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液,，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA,。12 000r/min于4℃離心30 min,，小心棄上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉淀2次,。12 000r/min于4℃離心5min,，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min,。
3．電泳前測(cè)序PCR產(chǎn)物的處理,。
(1) 加入12μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩,，讓其充分溶解DNA沉淀,，稍離心。
(2) 將溶液轉(zhuǎn)移蓋體分離的0.2ml PCR管中,，稍離心,。
(3) 在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95℃ 2min)，冰中驟冷,，待上機(jī),。
4．上機(jī)操作 按儀器操作說(shuō)明書(shū)安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正,，人工手動(dòng)灌膠和建立運(yùn)行的測(cè)序順序文件,。儀器將自動(dòng)灌膠毛細(xì)管，1.2kV預(yù)電泳5min,，按編程次序自動(dòng)進(jìn)樣,，再預(yù)電泳(1.2kV,，20min)，在7.5kV下電泳2h,。電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)清洗,，灌膠，進(jìn)下一樣品,，預(yù)電泳和電泳,。每一個(gè)樣品電泳總時(shí)間為2.5h。電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)分析或打印出彩色測(cè)序圖譜,。
5．儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析,，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序序列已知,，可通過(guò)序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處,，提高工作效率。
6．測(cè)序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng),。
【計(jì)算】
測(cè)序反應(yīng)度計(jì)算公式：*－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650×*差異堿基即測(cè)定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基,，N為儀器不能辨讀的堿基,。
【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】
1．ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器,，需專(zhuān)人操作、管理和維護(hù),。
2．本實(shí)驗(yàn)測(cè)序PCR反應(yīng)的總體積是5μl,，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要,，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外,，選用PE公司的PCR管。如PCR結(jié)束后PCR液小于4～4.5μl,，則此PCR反應(yīng)可能失敗,，不必進(jìn)行純化和上樣。
3．作為測(cè)序用戶來(lái)說(shuō),，只需提供純化好的DNA樣品和引物,，一個(gè)測(cè)序PCR反應(yīng)使用的模板不同，需要的DNA量也就不同,，PCR測(cè)序所需模板的量較少,，一般PCR產(chǎn)物需30～90ng，單鏈DNA需50～100ng,，雙鏈DNA需200～500ng,，DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6～2.0，用去離子水或三蒸水溶解DNA,，不用TE緩沖液溶解,。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好,。
4．本實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)序試劑盒是BigDye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測(cè)序試劑盒，一般可測(cè)DNA長(zhǎng)度為650bp左右,。本儀器DNA測(cè)序度為(98.5±0.5) %,，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測(cè)定的長(zhǎng)度超過(guò)了650bp,，則需設(shè)計(jì)另外的引物,。為保證測(cè)序更為準(zhǔn)確，可設(shè)計(jì)反向引物對(duì)同一模板進(jìn)行測(cè)序,，相互印證,。對(duì)于N堿基可進(jìn)行人工核對(duì)，有時(shí)可以辨讀出來(lái),。為提高測(cè)序的度,，根據(jù)星號(hào)提示位置，可人工分析該處彩色圖譜,，對(duì)該處堿基作進(jìn)一步核對(duì)