產(chǎn)品簡介
詳細介紹
美國ABI 310基因測序儀
DNA序列測定分手工測序和自動測序,,手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法,。自動化測序?qū)嶋H上已成為當今DNA序列分析的主流,。美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型,、377型、310型,、3700和3100型等DNA測序儀,,其中310型是臨床檢測實驗室中使用多的一種型號。
美國ABI 310基因測序儀 【原理】
ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀),,采用毛細管電泳技術取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳,,應用該公司的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法),因此通過單引物PCR測序反應,生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物,,使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內(nèi)電泳,,從而避免了泳道間遷移率差異的影響,大大提高了測序的度,。由于分子大小不同,,在毛細管電泳中的遷移率也不同,當其通過毛細管讀數(shù)窗口段時,,激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測,,激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光,以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,,并在CCD攝影機上同步成像,,分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列,從而達到DNA測序的目的,。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜,、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠,、自動進樣,、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物,,包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4),。這些凝膠顆粒孔徑均一,,避免了配膠條件不*對測序精度的影響,。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦,、彩色打印機和電泳等附件組成,。電腦中則包括資料收集,分析和儀器運行等軟件,。它使用CCD攝影機檢測器,,使DNA測序縮短2.5h,PCR片段大小分析和定量分析為10~40min,。
由于該儀器具有DNA測序,,PCR片段大小分析和定量分析等功能,,因此可進行DNA測序,、雜合子分析、單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP),、微衛(wèi)星序列分析,、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外,,還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析,、基因突變檢測、HLA配型,、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定,、微生物與病毒的分型與鑒定等。
美國ABI 310基因測序儀 【試劑與器材】
1.BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix,,內(nèi)含PE四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP,,AmpliTaq DNA polymerase FS,反應緩沖液等,。
2.pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2g/L,,試劑盒配套試劑。
3.M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,,3.2μmol/L,,即3.2pmol/μl,試劑盒配套試劑,。
4.DNA測序模板 可以是PCR產(chǎn)物,、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應調(diào)整在PCR反應時取量1μl為宜,。本實驗測定的質(zhì)粒DNA,,濃度為0.2g/L,即200ng/μl,。
5.引物 需根據(jù)所要測定的DNA片段設計正向或反向引物,,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物,,如M13(-21)引物,T7引物等,。
6.滅菌去離子水或三蒸水,。
7.0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離,PE公司產(chǎn)品,。
8.3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc•3H2O溶于70ml蒸餾水中,,冰醋酸調(diào)pH5.2,定容100ml,,高壓滅菌后分裝,。
9.70%乙醇和無水乙醇。
10.NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻,,室溫可保存1年,。
11.POP 6測序膠 ABI產(chǎn)品,。
12.模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品。
13.10×電泳緩沖液 ABI產(chǎn)品,。
14.ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀,。
15.2400型或9600型PCR儀。
16.臺式冷凍高速離心機,。
17.臺式高速離心機或袖珍離心機,。
【操作步驟】
1.PCR測序反應
(1) 取0.2ml的PCR管,,用記號筆編號,,將管插在顆粒冰中,,按下表加試劑:
所加試劑 測定模板管 標準對照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待測的質(zhì)粒DNA 1μl -
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA - 1μl
待測DNA的正向引物 1μl -
M13(-21)引物 - 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應體積5μl,不加輕礦物油或石蠟油,,蓋緊PCR管,,用手指彈管混勻,稍離心,。
(2) 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增,。98℃變性2min后進行PCR循環(huán),PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10s,,50℃ 5s,,60℃4min,25個循環(huán),,擴增結(jié)束后設置4℃保溫,。
2.醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
(1) 將混合物離心,將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中,。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液,,充分振蕩,置冰上10min以沉淀DNA,。12 000r/min于4℃離心30 min,,小心棄上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉淀2次,。12 000r/min于4℃離心5min,,小心棄上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min,。
3.電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理,。
(1) 加入12μl的TSR于離心管中,劇烈振蕩,,讓其充分溶解DNA沉淀,,稍離心。
(2) 將溶液轉(zhuǎn)移蓋體分離的0.2ml PCR管中,,稍離心,。
(3) 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2min),,冰中驟冷,,待上機,。
4.上機操作 按儀器操作說明書安裝毛細管,進行毛細管位置的校正,,人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件,。儀器將自動灌膠毛細管,1.2kV預電泳5min,,按編程次序自動進樣,,再預電泳(1.2kV,20min),,在7.5kV下電泳2h,。電泳結(jié)束后儀器會自動清洗,灌膠,,進下一樣品,,預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h,。電泳結(jié)束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜,。
5.儀器將自動進行序列分析,并可根據(jù)用戶要求進行序列比較,。如測序序列已知,,可通過序列比較以星號標出差異堿基處,提高工作效率,。
6.測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng),。
【計算】
測序反應度計算公式:*-差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650×*差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基,N為儀器不能辨讀的堿基,。
【注意事項與評價】
1.ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器,,需專人操作、管理和維護,。
2.本實驗測序PCR反應的總體積是5μl,,而且未加礦物油覆蓋,所以PCR管蓋的密封性很重要,,除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外,,選用PE公司的PCR管。如PCR結(jié)束后PCR液小于4~4.5μl,,則此PCR反應可能失敗,,不必進行純化和上樣。
3.作為測序用戶來說,,只需提供純化好的DNA樣品和引物,,一個測序PCR反應使用的模板不同,,需要的DNA量也就不同,PCR測序所需模板的量較少,,一般PCR產(chǎn)物需30~90ng,,單鏈DNA需50~100ng,雙鏈DNA需200~500ng,,DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6~2.0,,用去離子水或三蒸水溶解DNA,不用TE緩沖液溶解,。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好,。
4.本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒,一般可測DNA長度為650bp左右,。本儀器DNA測序度為(98.5±0.5) %,,儀器不能辨讀的堿基N<2%,所需測定的長度超過了650bp,,則需設計另外的引物,。為保證測序更為準確,可設計反向引物對同一模板進行測序,,相互印證,。對于N堿基可進行人工核對,有時可以辨讀出來,。為提高測序的度,,根據(jù)星號提示位置,可人工分析該處彩色圖譜,,對該處堿基作進一步核對