將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后,，完成高溫變性，低溫復(fù)性,，適溫延伸的熱循環(huán),，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針被切斷,，熒光素游離于反應(yīng)體系中,，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加,，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長,，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得Ct值,，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照,，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。
Ct值（Cycle threshold,，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)
（如圖1所示）,。
1. 熒光閾值（threshold）的設(shè)定
PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值與起始模板的關(guān)系
每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下,。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù),，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量,。
起始拷貝數(shù)越多,，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),，縱坐標(biāo)代Ct值。因此,，只要獲得未知樣品的Ct值,，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán),。探針完整時,，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時,，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析,，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺,。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中,，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,，發(fā)射熒光信號,，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步,。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合,，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異,。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針,，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近,，不會產(chǎn)生熒光,。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對,，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光[2] ,。
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