流式細(xì)胞儀技術(shù)概述
閱讀：2799 發(fā)布時(shí)間：2015-9-16
流式細(xì)胞儀技術(shù)，主要是測(cè)量群體中單個(gè)細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經(jīng)染色的細(xì)胞在懸液中以單行流過(guò)高強(qiáng)度光源的焦點(diǎn),，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)焦點(diǎn)時(shí),，發(fā)出一束散射光/或熒光。它們經(jīng)過(guò)過(guò)濾及光鏡系統(tǒng)收集到達(dá)一個(gè)光電檢測(cè)器(光電倍增管或一個(gè)固態(tài)裝置),，光檢測(cè)器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號(hào),，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化后而成整數(shù)，然后進(jìn)行電子存儲(chǔ),，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進(jìn)行分析,。其優(yōu)點(diǎn)如下：
1、具有操作簡(jiǎn)便,，只要將染色的單個(gè)細(xì)胞推入儀器中,，就會(huì)得出數(shù)據(jù)。
2,、具有較高的靈敏度及測(cè)定速度,，而且每次可測(cè)出許多數(shù)據(jù)，一般情況下,，每秒可測(cè)5000個(gè)細(xì)胞,，能迅速分析和記數(shù)大量細(xì)胞，并能準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)群體中熒光標(biāo)記細(xì)胞的比例,。
3,、應(yīng)用廣泛，即可用于測(cè)定細(xì)胞活力,、繁殖周期和細(xì)胞定型分析,，也可區(qū)別死亡細(xì)胞、分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群,，既可測(cè)定DNA和RNA,、測(cè)凋亡峰，又可測(cè)蛋白含量,，特別是胞漿蛋白,。
一、樣品的制備
流式細(xì)胞儀是測(cè)定一個(gè)或重復(fù)的每個(gè)顆粒經(jīng)光路的信號(hào),，因此,，細(xì)胞必須做成單個(gè)細(xì)胞懸浮狀態(tài)，不能聚集,，也不允許有細(xì)胞碎片存在,。所用染料必須特異(如特異單抗)，而且不允許滲透至載液中,。
標(biāo)本如果是屬于淋巴細(xì)胞等血細(xì)胞,、骨髓細(xì)胞或白血病細(xì)胞系或類淋巴細(xì)胞系，要經(jīng)Ficoll分離，作單細(xì)胞分離處理,，但若為實(shí)體組織或貼壁生長(zhǎng)的上皮成纖維樣細(xì)胞,，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等),，化學(xué)法(EDTA,、EGTA和檸檬酸鹽)消化分散液或洗液用無(wú)鈣、鎂PBS,，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L，并同時(shí)采用機(jī)械分散法,，將經(jīng)消化處理的膨松組織,，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重懸,，過(guò)一下尼龍或不銹鋼網(wǎng)篩100μm和20μm,。細(xì)胞濃度要保證在1～2×106/ml。
若標(biāo)本用于測(cè)定單個(gè)細(xì)胞,，需加入1～5mg/L的DNAase,，將有助于阻止破碎細(xì)胞釋放的DNA造成細(xì)胞再聚集，但是若分離的細(xì)胞要作DNA含量測(cè)定之用時(shí),，則切勿加DNAase,。
二、懸浮細(xì)胞的固定
上述制備的活細(xì)胞即可用于流式細(xì)胞儀分析,，如果染色和流式分析要拖后進(jìn)行,，或?yàn)榱颂岣呷旧Ч瑒t要將細(xì)胞預(yù)固定,。乙醇固定是常用的方法,。
1、固定方法：
(1)甲醛法：在細(xì)胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12～18小時(shí),。
(2)乙醇法：細(xì)胞懸于PBS中,，緩慢加入-20℃預(yù)冷的95%乙醇，使終濃度為70%,，冰浴30分鐘,。
(3)丙酮法：于細(xì)胞懸液中，緩慢加入冷丙酮,，使終濃度為85%,。
2、實(shí)例：
(1)用預(yù)冷的無(wú)鈣,、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液,，將細(xì)胞制成1×106細(xì)胞的懸液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達(dá)70%,。
(3)該細(xì)胞可在4℃下保存數(shù)日,。
(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇,，再將細(xì)胞懸于PBS中或要求的試劑中,。
三、流式細(xì)胞儀分析的應(yīng)用
(一)非染色細(xì)胞的光散射
一個(gè)粒子(如細(xì)胞)出現(xiàn)在一束光線中,，立即會(huì)干擾該光束,，造成該光束入射光的重分布，該細(xì)胞所獲能量則以衍散,、折射,、反射等復(fù)雜的參數(shù)形式重新發(fā)射出來(lái)，這些參數(shù)與細(xì)胞體積,、表面構(gòu)象,、內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成函數(shù)關(guān)系，可測(cè)低角前面約10°的光散射及90°的光散射,。
一般認(rèn)為,，90°位置的光散射值主要受細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)所致的光反射和折射影響，而低角前面10°位置的光散射則主要代表細(xì)胞大小,。光散射測(cè)量方法如下：
(1)將細(xì)胞懸浮于HBSS中,，濃度介于1×106～2×106/ml濃度之間。
(2)以懸浮細(xì)胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細(xì)胞貯藏池,。
(3)設(shè)定細(xì)胞流量為500個(gè)/S(秒),，以獲得*測(cè)定結(jié)果。
(二)染色法
1,、細(xì)胞的碘化丙錠(propiolium iodide,，PI)染色
PI和EB(溴化乙錠)為同類物質(zhì)，與EB一樣,，PI嵌入DNA雙螺旋中,，可使熒光強(qiáng)度增加約20倍，PI的熒光強(qiáng)度約為EB染色的1.8倍,，以488nm波長(zhǎng)激發(fā),，DNA/PI復(fù)合物zui大的發(fā)射波長(zhǎng)約為615nm。
1.1 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(3LL)DNA含量測(cè)定方法
(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊,，在培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS沖洗;
(2)去除結(jié)締組織及脂肪,，剪碎腫塊;
(3)小碎片移入1.20×38mm注射針，加壓使其通過(guò),，于4℃條件下重懸細(xì)胞于HBSS中,。
(4)將200～300μL細(xì)胞懸液(5×105細(xì)胞/ml)中加入3ml PI(50μg/ml),，染色3LL細(xì)胞，于4℃存放20～30分鐘,。
(5)測(cè)定580～750nm之間的發(fā)射熒光,，以去除末結(jié)合PI產(chǎn)生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。
注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000ml+PI5mg+1%Nonide P40水,。
1.2 培養(yǎng)細(xì)胞DNA的流式細(xì)胞儀分析
(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基,，以HBSS沖洗二次;
(2)加入PI5ml于培養(yǎng)皿中，在4℃放10分鐘;
(3)用吸管反復(fù)次打細(xì)胞,，使細(xì)胞破壞,，胞核釋放出來(lái)，再行流式細(xì)胞儀分析,。
1.3 完整細(xì)胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的細(xì)胞懸液,，離心，去固定液;
(2)室溫條件下加入PI染色一批細(xì)胞(105～106細(xì)胞/ml),，時(shí)間為30分鐘，然后行流式細(xì)胞儀分析,。
1.4 光輝霉素和PI的DNA染色
在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過(guò)程中,，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，該染色技術(shù)主要用于實(shí)體腫瘤組織,，精子細(xì)胞及婦科標(biāo)本,，同時(shí)也適用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。
(1)分離制備的細(xì)胞懸液即可使用,，若用70%乙醇固定可保存一周,。
(2)以PI/光輝霉素染色，4℃1小時(shí)(PI為10mg/L,、光輝霉素為10mg/L),。
(3)染色后進(jìn)樣，以100W汞燈作為激光光源,，使用BG123nm阻斷濾片,，疊加K590型高通濾法(one seep filter)。
2,、DNA和RNA的鑒別染色
利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA,。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細(xì)胞核酸,，或作溶酶體的一種標(biāo)記,。觀察死亡細(xì)胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群體。雖然測(cè)定DNA和RNA含量時(shí)較難獲得好的重復(fù)性結(jié)果,，但該方法已被許多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用,。方法如下：
(1)試劑：
溶液A：低溫保存,，穩(wěn)定期約2周。
Triton X-100(0.1%0.1ml,，1mol/LHCL 8ml
1mol/LNaCI15ml蒸餾水76ml,，PH1.5(100ml)
溶液B：穩(wěn)定期數(shù)月，除菌以后(高壓或過(guò)濾)貯存,。
0.01mol/LEDTA10ml,，1mol/LNaCI15ml
0.4mol/LNa2HPO4 31.5ml，0.2mol/L檸檬酸18.5ml
蒸餾水24ml,，總體積為99ml,，pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應(yīng)小心),，吖啶橙應(yīng)用液0.1ml母液加9.9ml溶液B稀釋,。
注意：儀器鞘流系統(tǒng)應(yīng)保持4℃。
氬激光激發(fā)波488nm,，紅色熒光為DNA(F>600nm),，綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制細(xì)胞懸液，取0.2ml(8×106細(xì)胞/ml),，加入0.4ml溶液A,，4℃放置45～60秒。
②加1.2ml含吖啶橙的溶液B,，室溫2分鐘,。
③應(yīng)在加入溶液B后10分鐘內(nèi)進(jìn)流式細(xì)胞儀分析。
注意：①細(xì)胞數(shù)保持恒定;②核酸與吖啶橙的比例;③染色時(shí)間及溫度,。
(三)染色法的應(yīng)用
1,、變性及雙鏈DNA的鑒別染色
(1)試劑：
HBSS內(nèi)含1000u/ml RNA酶A，0.2mol/LKCl,，pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5mg/L(16.7μm),，0.2mol/L Na2HPO4 緩沖液，pH2.6,。
①2×106細(xì)胞懸于1mlHBSS/RNase液中,。
②37℃溫育1小時(shí)。
③將0.2ml細(xì)胞懸液(含4×105細(xì)胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5ml0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻,，20℃ 30分鐘,。
④加2ml吖啶橙染色2分鐘。
⑤綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細(xì)胞中單鏈及雙鏈DNA含量,。
2,、DNA與癌基因探針雙標(biāo)記測(cè)定
這種測(cè)定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標(biāo)記癌基因表達(dá)產(chǎn)物，然后用PI標(biāo)記DNA,，現(xiàn)以研究白血病細(xì)胞增殖與癌基因的關(guān)系說(shuō)明操作步驟：
(1)制備白血病細(xì)胞懸液,，用100%甲醇在-20℃固定10分鐘,。
(2)取50μl50mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras,，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結(jié)合),，4℃作用30～45分鐘。
(3)用PB離心洗滌2次,，重懸浮于50μlHBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清),。
(4)加入50μl1：200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分鐘,。
(5)同(3)洗滌后加入50μl1：40的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG,，4℃反應(yīng)30～45分鐘。
(6)同(3)洗滌后,，細(xì)胞用RNA酶消化,，室溫20～30分鐘。
(7)同(3)洗滌后,，用PI染液染20分鐘,。
(8)同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定,。FITC染色顯示ras癌基因表達(dá)產(chǎn)物,，PI染色顯示DNA含量。
注意事項(xiàng)：
①制備樣品時(shí),，離心次數(shù)不宜過(guò)多，防止細(xì)胞丟失和凝集;
②細(xì)胞固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),，不要用冰醋酸,、乙醇、苦咪酸及汞固定劑;
③為了降低本底,，應(yīng)將細(xì)胞表面未結(jié)合的熒光染料洗凈;
④進(jìn)行雙標(biāo)記沉淀時(shí),，應(yīng)盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。
3,、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進(jìn)行細(xì)胞周期分析
(1)試劑：
用培養(yǎng)基配制33mg/LBrdu及脫氧細(xì)胞苷26.4g/ml,。
染色液：Hoechst33258溶于PBS，細(xì)胞染色24小時(shí)后進(jìn)行分析,，據(jù)報(bào)道染色的穩(wěn)定時(shí)間在30分鐘至24小時(shí)之間,。
(2)方法：
①將Brdu溶液按1：10加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。
②根據(jù)細(xì)胞周期時(shí)間不同,，選擇不同時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞,。
③孵育后，搖散細(xì)胞以傳代培養(yǎng),。
④直接用染液重懸細(xì)胞,，進(jìn)入流式細(xì)胞儀分析,。
Hoechst33258熒光值在410～580nm之間，需用330～360nm紫外光激發(fā),。應(yīng)特異性結(jié)合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對(duì),。因此，不僅特異性標(biāo)記DNA,，亦可標(biāo)記胸腺嘧啶,。在細(xì)胞周期分析時(shí)，在與細(xì)胞孵育過(guò)程加入Brdu,，Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶,，因此，處于合成期內(nèi)的細(xì)胞表面上仍保持二倍體狀態(tài),，并在分裂后G1峰的半峰處產(chǎn)生一新峰,，此項(xiàng)技術(shù)可用于直接測(cè)定細(xì)胞G2期及分裂時(shí)間。
4,、Hoechst33342染色活細(xì)胞DNA
(1)試劑：Hoechst 33342,，用蒸餾水配成0.25mol/L。
(2)方法：
①制備106/ml細(xì)胞懸液,，以Hoechst33342染色,，濃度為5～10mg/L ，室溫下20分鐘,。
②分析前切勿洗滌細(xì)胞,。
Hoechst33342可用作細(xì)胞DNA的活體染料，據(jù)信可在保持細(xì)胞活性的同時(shí),，呈現(xiàn)出相當(dāng)好的DNA化學(xué)計(jì)量關(guān)系,，激發(fā)波在紫外范圍350～363nm之間，發(fā)射波則在450nm處,。
5,、以異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白質(zhì)。
(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40mg/LRNase的PBS配成0.1～1.0mg/L濃度,。
(2)方法：
①染色前用終濃度70%乙醇固定細(xì)胞,，至少18小時(shí)。
②離心固定細(xì)胞,，棄去固定液,。
③室溫下用FIFC染色細(xì)胞蛋白，30分鐘,。
④流式細(xì)胞儀分析,，使用氬激光，激發(fā)波長(zhǎng)488nm,，熒光發(fā)射波長(zhǎng)515～535nm,。
也可于固定細(xì)胞中,，以18mg/L(0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對(duì)DNA和蛋白質(zhì)雙重染色,，分別呈現(xiàn)紅色熒光(DNA)和綠色熒光(蛋白質(zhì)),。
6、熒光素抗體的應(yīng)用
該技術(shù)既可用于檢測(cè)帶有特異性膜抗原的細(xì)胞,，可用熒光素或若丹明標(biāo)記單克隆抗體處理上述細(xì)胞;也可用于測(cè)定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL-2蛋白,，抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸鹽緩沖液Eagle’s MEM稀釋FIFC連接的抗體內(nèi)含0.1%疊氮鈉,、2%牛血清,。為判定FIFC抗體的zui適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細(xì)胞中加入50μl不同濃度的稀釋液,，再以熒光顯微鏡確認(rèn)*染色濃度,。使用抗人LEU-I抗體分析時(shí)，應(yīng)稀釋成5mg/L或0.25mg/L,。無(wú)論鼠或人細(xì)胞在2×107濃度時(shí)其存活率應(yīng)在90%以上,。
方法：
(1)于微量滴定板加入50μl抗體稀釋度，再加入50μl細(xì)胞懸液,，混勻,。
(2)冰浴45分鐘，離心滴定板(1500r/min10分鐘),。
(3)棄上清,，以培養(yǎng)基100μl洗滌細(xì)胞沉淀2次，每次洗滌后用1500r/min10分鐘,，棄上清,。
(4)以1ml預(yù)冷的培養(yǎng)基配成1×106細(xì)胞/ml的已染色細(xì)胞懸液，進(jìn)樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃),。
目前流式細(xì)胞儀(FCM)已在各學(xué)科中獲得應(yīng)用。
①細(xì)胞生物學(xué)：定量分析細(xì)胞周期并分選不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞;分析生物大分子如DNA,、RNA,、抗原、癌基因表達(dá)產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系,，進(jìn)行染色體核型分析,，并可純化X或Y染色體。
②腫瘤學(xué)：DNA倍體含量測(cè)定是鑒別良,、惡性腫瘤的特異指標(biāo),。近年來(lái)已應(yīng)用DNA倍體測(cè)定技術(shù)，對(duì)白血病,、淋巴瘤及肺癌,、膀胱癌,、前列腺癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細(xì)胞,。
③免疫學(xué)：研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系;進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的分型與純化;分析淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系;免疫缺陷病如艾滋病的診斷;器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)等,。
④血液學(xué)：血液細(xì)胞的分類、分型,，造血細(xì)胞分化的研究,，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過(guò)氧化物酶,、非特異性酯酶等;用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細(xì)胞分化成熟與細(xì)胞增殖周期變化的關(guān)系,，檢測(cè)母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽(yáng)性細(xì)胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴(yán)重溶血;檢測(cè)血液中循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病,，如紅斑狼瘡等,。
⑤藥物學(xué)：檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥的作用機(jī)制,，亦可用于篩選新藥,，如化療藥物對(duì)腫瘤的凋亡機(jī)制，可通過(guò)測(cè)DNA凋亡峰,，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等,。
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