實(shí)時熒光定量PCR的使用步驟
1 樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細(xì)胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解,。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋,。手動劇烈振蕩管體15秒后,，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,，中間層以及無色水相上層,。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%,。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后,，于4℃下12000rpm 離心10分鐘,。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊,。
④RNA清洗 移去上清液,，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀,?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘,。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用,。
2 RNA質(zhì)量檢測
1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零,。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,，測定RNA溶液 濃度和純度,。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 ?g/ml,。具體計算如下：
RNA溶于40 ?l DEPC水中,，取5ul，1:100稀釋至495?l的TE中,，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l
取5ul用來測量以后,，剩余樣品RNA為35 ?l，剩余RNA總量為：
35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,，比值范圍1.8到2.1,。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃,，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M),。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS,，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液,。膠凝后取下梳子,，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米,。
②準(zhǔn)備RNA樣品
取3?gRNA,，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml,。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性,。
③電泳
上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔,。5-6V/cm電壓下2h,，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。
④紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型）,，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍,。還有可能觀察到一個更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成,。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散,。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果,。
3 樣品cDNA合成
①反應(yīng)體系
序號 反應(yīng)物 劑量
1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 總體積 10μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心,。
②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,，37℃水浴60分鐘,。
③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液,，保存于-80℃待用,。
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