分光光度計是一類很重要的分析儀器,無論在物理學(xué)、化學(xué),、生物學(xué),、醫(yī)學(xué)、材料學(xué),、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域,還是在化工,、醫(yī)藥、環(huán)境檢測,、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應(yīng)用,。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量,。
超微量分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量,。核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,，單鏈、雙鏈DNA,，以及RNA,。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液,。然而,，實驗并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實上,，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度,。如德國伯赫Colibri超微量分光光度計的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的,。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時,，離子濃度太高,，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A,。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分,，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個操作事項,。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm,。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,。蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
比色方法一般有BCA，Bradford,，Lowry等幾種方法,。
Lowry法：以最早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高,。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA,，Tritonx-100，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法,。
BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2反應(yīng)產(chǎn)生Cu,，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長,。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,，操作簡單,，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。
Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是,，敏感度好,，是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍；操作更簡單,，速度更快,；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時,，方便結(jié)果,；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容,。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無可比性,。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,，感到迷惑，究竟該相信哪種方法,？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白,，結(jié)果Lowry,，BCA測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著,。即使是測定同一樣品,，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測試后的濃度也不一致,。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml,，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度2.64mg/ml。因此,，在選擇比色法之前,，最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。另外,，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是,，反應(yīng)后1011分光光度計的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品）,，都必須在此時間內(nèi)測試,。時間過長，得到的吸光值變小,，換算的濃度值降低,。除此，反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因,。此外，非常重要的是,，最好是用塑料的比色法,。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,，因為反應(yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確,。實驗室確定細(xì)菌生長密度和生長期,，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗,，需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度,。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液,。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),，做出校正曲線,。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng),。另外,，需注意的是，測試的樣品不能離心,，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài),。
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